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プルダウンアッセイとはどういうものか教えて下さい。

A 回答 (2件)

以下の参考URLが参考になりますでしょうか?


「Cell Lysis and Pull-down Assay」
http://www.nig.ac.jp/labs/AR97ja/3/A/Aa2-4.html
(複合体共沈法)
http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/manualf/e6 …
(In vitro translationとGST-pull down assay)

ご参考まで。

参考URL:http://www.my-pharm.ac.jp/~khigashi/higashi/prot …
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↓のサイトにプロトコルがのってます。

どうやら免疫沈降法かと思われます。

参考URL:http://www.my-pharm.ac.jp/~khigashi/higashi/inde …
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Qウェスタンブロットのサンプルのinputの意味

今呼んでいる分子生物学系の論文なのですが、ウェスタンブロットの結果のFig中に
C:control、IP:immunoprecipitationの他にもう一つ、inputと書いてあるサンプルがあります。これは一体どのような意味を持つサンプルなのでしょうか。
微妙に専門外なのでホントに基礎的なことだったらすみません。
詳しい方解答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

正確な表現ではないですが数式で書くと
Input = IP+ flow through となります。
入れた物 = 抗体についた物+つかなかった物
ただ全量泳動することはできませんので、一般にNo.1のかたが書かれたように1% Inputとか10% inputとして泳動します。
抗体反応中の分解や容器等への付着、洗浄中の脱落および吸着の定量性を示したい場合にはflow throughを示しますが、一般にIPのデーターでは、どのようなサンプルを使用し、抗体でどの程度濃縮されたかを示すにとどめますので、ご質問の3つのレーンとなります。inputには、使用したサンプルにどのくらいの量の目的の因子が入っていたかを示す意義が主ですが、論文中のどこにも%を書いていないものもあります。そのときには、単にそのバンドの高さを示すのみの意味になってしまいます。
メンブレン全体をfigureにする場合には、inputのレーンが抗体の特異性などを示すために使うこともあります。
ご参考までに。

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q可溶性画分と不溶性画分について

タンパク実験の初心者です。タンパク実験でリコンビナントタンパクを精製する際、なぜ可溶性画分だと精製しやすくて、不溶性画分だと精製しにくのですか??またインクルージョンボディとは具体的にどういう状態なのですか??原理がいまいち理解できていないのだと思います。すごく馬鹿な質問ですがよろしくお願いします。

Aベストアンサー

こんばんわ。
組み換えタンパクの精製には通常カラムを用います。
(というのも、例えば大腸菌でタンパクを発現させても、不要タンパクが大量に含まれるため)
この時、目的タンパクが可溶性だとカラムを通すことができますが、不溶性だとカラムが目詰まりしてしまい、精製が困難になります。
No.1の方も書かれているように、タグ付きタンパクを精製する場合には、タグを認識する抗体をくっつけたカラムを用い、例えば抗体を精製する場合は、抗体のイムノグロブリンを認識・結合するようなカラムを用います。

インクルージョンボディとは、例えば大腸菌で酵素などを発現させたときに、その酵素により自己分解されるのを防ぐために、大腸菌が酵素の構造を無茶苦茶にする、というものです。
というのも、一般的に酵素などのタンパクは立体構造が大切であり、これが崩れるとその酵素学的性質を失うということに由来しています。

こんな感じでOKかしらん?

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Qmock細胞とは?

細胞株を使った研究論文でmockという細胞がよく書かれています.どのような細胞のことを指すのでしょうか?

いくつかの論文を見て,何か対象の処理を行っていない細胞のことを意味するか,あるいか親株(継代前の細胞)を意味するかとは感じました.

細胞について素人同然ですが,宜しくご教授願います.

Aベストアンサー

組織培養でmock cell(モック細胞)と言う場合、通常は目的とする遺伝子を含まないベクターのみでトランスフェクションを行った細胞を指します。

parental wild-type(親株)とともに、transfectant(形質移入株)に対する比較対照として用いられます。

"mock"は、「本当の被験体に良く似ている偽物」という意味です。

Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

LB(Amp)のプレート培地を作製する時にいつも思うことです。

オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

QkDaからbpへの変換について

例えば206kDaの分子量をbpで表すには、どのような計算方法を取ったらいいのでしょうか??それとも、計算できないのでしょうか?皆さん、解答を宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kDaはタンパク質の分子量でしょうか

http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/010001005.shtml

で概算できます。

アミノ酸によって分子量は変わるので、
kDaから正確なアミノ酸数は計算できないため、
正確なbpは計算できません。

QSDS-PAGEで、ゲルを作製するときに重層する蒸留水について

SDS-PAGEでゲルを作製するとき、分離ゲルに蒸留水を重層します。しかし、かなりそっと重層しても分離ゲルと蒸留水が混ざってしまい、ゲルが硬化した後に界面が凹凸のある状態に乱れています。蒸留水を重層するとき、何かよい方法はないでしょうか?また、蒸留水は必ず重層しないといけないのでしょうか?蒸留水を重層しなくても大丈夫なら、重層せずに、分離ゲルが固まった後に濃縮ゲルを重ねようと考えているのですが…?

Aベストアンサー

アクリルアミドは酸素があると重合が阻害されますし、結局泡なんかで表面が乱れるので重層した方がいいと思います。

改善の余地としては、例えば分離ゲル溶液に~10%程度になるようにグリセロールを入れると比重の違いにより混ざり合いにくくなります。

もしくは、水より比重の軽い溶媒を重層する方法があります。例えば、水で飽和させた1-ブタノールなど。
具体的には50mlのチューブなどに、水とブタノールを半分ずつ位加えてシェイクし静置、ブタノールは上層、水は下層に分離するので上層を使用してください。

どちらか一方でかなり改善されると思いますので、楽そうな方をお試しください。


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