現在、研究でとある遺伝子のクローニング実験を行っています。その遺伝子は、NCBIで調べ、その遺伝子の塩基配列が図示されました。その遺伝子の転写開始部位から下流に-10bpぐらいのとこからリバースプライマーを設計し、レフトプライマーを上流500、1000、2000bpで設計しました。なぜその遺伝子のプロモーター領域を増幅させるのでしょうか?
また、DNAの転写因子の結合部位予測を調べる理由はなんなんでしょうか?プライマー3というサイトでプライマーデザインを行い、そこに表示されたプライマーを色々いじくり使用しているのですが。
A 回答 (4件)
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No.4
- 回答日時:
真核生物で一般的にinitiation siteから-20~-25 bp(TATA boxなど)と-40~-110 bp(CAAT boxなど)あたりにプロモータがあるとされています。
これはinitiation siteから転写が開始さるための最小限のコアプロモータでで、これだけでは低レベルの構成的発現しかできません。遺伝子個有の発現調節のためには、さらにエンハンサー領域が必要で、その距離や位置(上流、下流、転写量域内)は多様です。コアプロモータと、それと近傍の上流域にあり、その遺伝子の基本的な発現を促す働きの強いエンハンサーをひっくるめて、広い意味で「プロモータ」と呼ぶこともあり、今回はこれを狙っているのでしょう。
No.3
- 回答日時:
#1です。
ええと、ということは、もう疑問は解決していると思うのですが・・・
プロモーター領域をPCRで増幅し、ベクターに組み込むということですね。
プロモーター領域をpGL3に入れてルシフェラーゼアッセイで転写活性を見たり、結合する転写因子を解析したりするのでしょうか。いいんじゃないすか?
No.2
- 回答日時:
>なぜその遺伝子のプロモーター領域を増幅させるのでしょうか?
>プロモーター領域の解析を行おうとしています。
答えが出ているようですが、何が質問なのでしょうか?
No.1
- 回答日時:
遺伝子(タンパク質のコード領域)の構造解析、つまりDNA塩基配列の決定がしたいのですか? それとも転写活性など、プロモーター領域に関する研究がしたいのですか?
文章から察すると、おそらく遺伝子の構造解析をしたいのではないかと思いますが、そうであればあなたが設計しているプライマーの場所は間違っています。
どうやらプロモーター領域の解析をしようとしているように見えます。
あと用語に関してですが、上流と下流、リバースプライマーとレフト(?)プライマーについて、もういちど確認していただけますか?
ご回答ありがとうございます。
プロモーター領域の解析を行おうとしています。
NCBIで調べたのは、DCTという遺伝子のmRNA配列を調べました。
reverse primerとforward primerの間違いでした!reverse primerはright primer、forward primerはleft primerと呼んでます。
文章が色々間違っているっぽいです;;;
下流に-10bpといったのは間違いで、転写開始部位を+1として約+10bpのところにreverse primerを作りました。-5/+11の場所です。
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