いくつのクローンを解析すれば環境を反映したデータだと言えるの

私はある水域の各水深に生息している微生物の環境DNA解析を行っています。DNA抽出後、PCR、ゲル抽出、T-ベクターを使ってライゲーション、形質転換、LB寒天培地に形質転換した大腸菌をまき翌日コロニーの青白判定を行い、コロニーPCR、LB液体培地で培養・精製、シーケンスにかけるといった流れで行っています。ここで、質問なんですがインサートが入ったポジティブなクローンをいくつシーケンス解析すればその環境を反映した充分なデータが得られたことになるのでしょうか？教えてください、お願いします。

No.3 ベストアンサー 回答者： CTAB 回答日時： 2008/12/24 13:58

　なんか、実験環境について答えてる方が多いみたいですが、これってクローニング解析の基本なので、そこは無視していいと思いますよ。

異や、もちろんプライマーはユニバーサルプライマー（まあこの場合は基本的に16S rRNA遺伝子用だと思いますが）を用いる必要があるでしょうけど。
　私の知っている限りで答えると、できれば100はほしいですね。200あればまあ十分な結果として使用していいかと。（卒論とかなら50とかでもいけなくは無いでしょうけど、ちょっとさびしいですね）
　ちなみに200とかやる場合はずべてをシーケンスにかけるのではなく、OTUでグルーピングして、代表だけを解析しますね。手間がかかりすぎますから。OTUはRFLPを2種類かければ十分かと。
　ちなみに、皆さん指摘してますが、PCRでバイアスがかかることや細菌のもつ遺伝子のコピー数の差などから、クローニング解析はどうしてもズレはでます。絶対的な反映というの一万クローンしても不可能ですので、そこだけは理解して実験してください。どのような微生物がいるか、そしてどの微生物が特に優先しているのか、くらいを調べるための手法ですので。

No.2 回答者： otx 回答日時： 2008/12/24 12:42

質問に答えるためには、実験の内容に踏み込んだ質問になってしまいます。

どのようなPCR（特にprimer）を行っていらっしゃるのでしょうか？
（遺伝子の名前とかは書けないと思いますが）

何か環境によって発現が変わっているかもしれない遺伝子のファミリーを想定していて、
そのファミリーの中で保存された領域の配列をprimerにしていらっしゃるのでしょうか？

もし、上記のようでなかったら、PCRから大腸菌に形質転換という作業は、そもそも単一の遺伝子を取り上げる作業ですので
いくつクローンをとっても同じものを見ているの過ぎないと思いますが・・・。

もし、上記のようなことであったとしても、私はいくつクローンをひろうといいか、よくわかりません。
ファミリーに存在する遺伝子の数（アイソフォームのような）がいくつあるのかにもよると思いますし。
第一、PCRでも増幅されるという作業があり、これが定量的に行われている必要がありますし（制御が難しい）、
形質転換でも、元々、多く存在するプラスミドの方が確率的により多く大腸菌に導入され、少ないものはより挿入されづらくなるというよりも、全くされない可能性も出てきます。つまり、もともと発現している遺伝子の量を反映していない可能性が高くなるからです。

考えれば、まだまだいろんなことが考えられると思います。

このような可能性を含めて、担当教官とどのように考えていくのかを
ディスカッションされることをお勧め致します。

研究、もしくは研究室の実情を知らない赤の他人がどうこう言っても
始まらないと思います。

がんばってください。

No.1 回答者： doc_sunday 回答日時： 2008/12/24 08:53

あまり専門とは言えませんが、

>いくつシーケンス解析すればその環境を反映した充分なデータが得られたことになる
もし、不幸にして差がない場合には、無数個の解析を行っても充分なデータではないことになるのでは？
それを避けるためには、一連の実験に先立って、統計処理の方法を決定しておく必要があります。
つまり「標準的な変位」の大きさを何らかの基準で択ばなくてはなりません。