ウェスタンブロット法での非特異バンド

ある分子量のタンパクをウェスタンブロットで検出したいのですが、目的位置のバンドは薄く、別の決まった位置に濃いバンドが出てしまいます。
毎回、サンプルバッファーと混ぜて95℃加熱処理し、Non-fat milkでのブロッキングなどは行っています。
原因は何でしょうか?解決法などありましたら教えてください。

No.3 ベストアンサー 回答者： sewingcough 回答日時： 2010/03/21 16:56

> タンパクの立体構造をほぐすためにも加熱処理は必須ですよね

これについては諸説あって・・・あまり大きな声では言えないのですが、
煮ない研究者さんも結構いらっしゃるという話は聞きます。
特に通常のSDS-PAGEの場合ならなおさらのこと・・・
まあ、毎回煮なければ再現性はとれるので大丈夫なんでしょうが、
その方々がおっしゃるには「サンプルバッファに入れた時点で変性する」
とのこと。これで問題が起きることはそんなにないそうです。
唯一問題が起こりうるのが、ジスルフィド結合がある場合。
メルカプトエタノールが失活したサンプルバッファを用いたり
煮なかったりすると、よくわからないことが起きやすいと。
まあこれはタンパク質大量発現の系での話なので、
臓器にそのまま適用できるかはわかりませんが・・・

そういえば、サンプルバッファのメルカプトエタノールはフレッシュですか？

この回答への補足

ありがとうございます。
サンプルバッファーは新しいものを使っているので大丈夫だと思います。
確かにサンプルバッファーと混ぜた時点で変性するというのは納得できる気がします。

補足日時：2010/03/21 19:27

No.4 回答者： otx 回答日時： 2010/03/24 15:42

はっきり言って、非特異的なバンドがでて困るという質問には

答えがこれだって書くのがむずかしいです。

使った抗体によるし、サンプルの調整によるし、
実際に実験をどのように行なっているかによるし、
それこそ挙げたらキリがありません。

状況が全くわからない者から言えることは、

１、ポジコンを置いて実験する。
目的のタンパク質が発現していることがわかっている組織or細胞（論文等で結果が示してある、
抗体のデータシートで示してある）サンプルを同時に使って実験していますか？
この結果如何で、少なくとも抗体と実験方法がワークしているということがわかると思います。

２、ネガコンを置いて実験する。
目的のタンパク質が発現していないとわかっているサンプルでどうなるか見てみましたか？
この結果如何で、そもそもこの抗体が何かわからないタンパク質を認識することがわかります。
また、１次抗体を使わないで２次抗体のみでやってみたときに出るバンドがあれば、
そもそもその１次抗体がワークしていなくて、２次抗体が違うものを認識しているとか、

基本的な実験だけでも、何が起こっているのかわかると思います。

原因を追及するために実験を組み立てる、組み立てることができるということも、重要なことです。

この回答へのお礼

ありがとうございまいた

お礼日時：2010/04/21 20:46

No.2 回答者： sewingcough 回答日時： 2010/03/20 20:04

> 例えばこれは目的タンパクの分解産物ってことはありますかね?

> (加熱処理で分解されたとか・・・)
> でも加熱処理は不可欠ですよね?
動物臓器は全く畑違いなので、一般論を。
あまり参考にならないかもしれませんが・・・
分解産物の可能性はもちろんあります。
例えばドメインAとドメインBの間に
ディスオーダーした構造があって
ドメインAを抗体が認識するなら、
熱や酵素で切断されたドメインAが多く釣れるかもしれません。
またA鎖とB鎖がジスルフィド結合してる独立な鎖の場合
還元剤で分解したA鎖が多く釣れてくるかもしれません。

> 内因性ペルオキシダーゼ阻害ってウェスタンでも
> よく行われているんですか?過ヨウ素酸溶液ですか?
私自身は使ったことがありませんが、手引きには時々書いてます。
詳しくは手引き書などをご参照ください。

この回答への補足

ありがとうございます。
培養細胞でも同様の現象が起こります。
その他のタンパクの多くはうまく発現してくれるのですが、特定のタンパクだけうまくいかないのです。
タンパクの立体構造をほぐすためにも加熱処理は必須ですよね。

補足日時：2010/03/21 11:09

No.1 回答者： sewingcough 回答日時： 2010/03/19 23:56

ウェスタンブロッティングで非特異が出る場合は、

例えば以下の点を見直すことになります。
(1)サンプル量を減らす
(2)ブロッキングの溶液濃度を上げる、時間を延ばす、温度を上げる
(3)抗体を希釈する
(4)抗体を見直す（モノクローナル抗体を使う、抗体を精製する、別のを使う）
(5)それでダメなら内在性ペルオキシダーゼをH2O2不活性化する
今回の場合、目的バンドよりも非特異の方が濃いので
(4)か(5)ですかねえ・・・？

あと、どういう実験をしているか質問だけからはみえませんが、
本当に目的タンパクということはありませんか？
たとえば、目的タンパクが何かと共有結合してりいるとか？

この回答への補足

ありがとうございます。
動物臓器でウェスタンしてます。
目的タンパクより100kDaほど低い位置に毎回濃いバンドが出てしまいます。

例えばこれは目的タンパクの分解産物ってことはありますかね?
(加熱処理で分解されたとか・・・)
でも加熱処理は不可欠ですよね?

内因性ペルオキシダーゼ阻害ってウェスタンでもよく行われているんですか?過ヨウ素酸溶液ですか?

補足日時：2010/03/20 15:57