ウエスタンブロット 発色の原理は・・・

こんにちは。よろしくお願いします。

職場で、ウエスタンブロットを行っています。

タンパク質を転写したメンブレンに、サンプルを反応させて、１次抗体、２次抗体後、過酸化水素ごく少量にDABを入れて、しばらく置くと発色し、水中に入れ反応を止めます。

ここで、そぼくな疑問なのですが、過酸化水素とDABを入れるとどうして発色するのでしょうか？

DABがペルオキシダーゼ基質ということは知っています。

色々ネットで調べましたが分かりませんでした。
よろしくお願いします。

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/09/02 19:47

＞DABがペルオキシダーゼ基質ということは知っています。

これは違います。peroxidaseの基質は過酸化水素(H2O2)です。反応産物として水と過酸化物イオン（O2^2-)を生じ、過酸化物イオンがDABを酸化します。するとDABは重合して不溶性の沈殿を生じるので、重合したDABが沈着したところが茶褐色に染まるのです。この色は、水に溶けていない状態のDABと同じで、反応によって発色団が新たに生じるわけではないと思います。

この回答へのお礼

ありがとうございます。

ペルオキシダーゼの基質は過酸化水素だったんですね。これでスッキリしました。

DABは、酸化される前に、すぐに２次抗体と結合しているのですか？？
また、ペルオキシダーゼはどこにでもあるのですか？？

お礼日時：2006/09/02 21:33

No.2 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/09/02 22:17

二次抗体にperoxidaseが標識（label)としてくっつけられています。

DABとH2O2は反応液の中に溶けていて全体にゆきわたります。メンブレン上のタンパク質の中の抗原に一次抗体がつき、一次抗体に反応する二次抗体がつきます。二次抗体が存在するところでperoxidaseが触媒反応をし、その場で不溶性のDABを沈着させるので、目的の抗原のあるところが可視化できるわけです。

一次抗体に直接標識し検出する方法を直接抗体法、無標識の一次抗体を、それに特異的に反応する標識二次抗体で検出する方法を間接抗体法といいます。
標識としては、蛍光物質、ラジオアイソトープ、酵素などがあります。
標識に使われる酵素としては、peroxidase、Alkaline phosphataseなどがあります。
ご質問の例は、peroxidaseを用いた間接酵素抗体法となります。

この回答へのお礼

度々ありがとうございました。
疑問が解決し、感謝しております。

二次抗体にペルオキシダーゼがついているのですね。

そこで、過酸化水素を分解して酸素を出して、そばにあるDABを酸化させるのですね。

だから、過酸化水素を多めにすると、発色が良くなるのですね。

もうひとつ質問なのですが（すみません）水中に入れて反応を停止させた後、色が濃くなってくることがあるのですが、これは、DABの酸化反応がゆっくり進んでいるからですか？

お礼日時：2006/09/03 10:03

No.3 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/09/03 11:12

おそらくメンブレンに染み込んだ基質が反応を続けるからでしょう。

酵素抗体法では、基質が染み込んでいるために、洗ってもすぐに反応が止まらないのでそういうことは良くあります。ある時点でぴったり反応を止める必要があるときは酵素の阻害剤を加える場合もあります。
また、長期保存すると染み込んだ基質が徐々に発色してバックグラウンドがあがる（メンブレン全体が着色してくる）こともあります。

洗っても基質が完全に取り除かれていないという可能性があるということは、上記の問題のほかに、取り扱い上の問題もありますね。DABは発がん物質であるとされていますから。DABそのものの取り扱いに注意するだけでなく、発色後のメンブレンもDABを含んでいる可能性を考えてそれなりの扱いをしたほうが良いでしょう。

なお、DABより発色が良く（より見やすい色）で安全性のより高い基質もいろいろあります。DABは、生物組織の抗体染色ではいまだに良く使われていますが、ウェスタンの場合はもうあまり使われていないと思います。

この回答へのお礼

geneticist12さんのおかげで、本当に助かっています。
涙が出るほどうれしいです。感謝しています。

図々しいですが、DABよりも安全で発色の良い基質は、どんな物がありますか？（質問のし過ぎですみません）

ネットで見た感じだと、TMB、各種化学発光基質とありましたが、これらはDMBよりも発色が良いですか？

お礼日時：2006/09/03 14:33

No.4 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/09/03 16:18

まず補足から、

純度の高いDABはそんなに着色していないだそうです。
試薬として売られているのは、純度がそんなに高くないのでやや着色していますけれど。やはり、酸化されたときに不溶性になるだけでなく、発色も強くなるようです。
また、光に当たると着色が強まるということなので、発色反応後、洗っているうちに色が濃くなるというのは、そのせいもあるかもしれません。

DABは黄褐色～茶褐色に染まるので、視認性があまり良くなく、写真やスキャナーにも写りにくいところがあります（そのため、コバルトなどの金属塩を加えて黒く染める方法もあります）。
DABの代替としては、TMBとAECがあります。前者は青色、後者は赤色に発色するので有利です。特にAECはDABより毒性が低い（程度の問題でしょうが）ということで、利用が増えているようです。

ウェスタンでは化学発光が最も感度が良く、もっとも良く使われています。X線フィルムに露光して現像するか、高感度のCCDカメラで取り込むかして検出します。そのために、現像用の設備や取り込み用の装置が必要です。

また、アルカリフォスファターゼ標識の二次抗体を使えば、NBT/BCIPで青紫色に発色させるほか、化学発光でも検出できます。アルカリフォスファターゼの方がパーオキシダーゼより高感度ですが、生物材料由来のフォスファターゼ活性がある場合、ノイズを生じることがあるなど、適しているかどうかはケースバイケースでしょう。

この回答へのお礼

geneticist12さんには本当に感謝しきれません。

AECについて調べてみようと思います。

DABは毒性が高く、廃棄が面倒ですよね。。。

お礼日時：2006/09/03 16:38