大腸菌(pBR322)プラスミドを使ってアルカリSDS法を用いてプラスミド精製実験をしたのですが。
アガロースゲル電気泳動の結果が普通だったら、オープンサーキュラー、リニアー、スーパーコイルと出てくるはずが
スーパーコイルとRNAしか出ませんでした。
先生はそれは、いいことだと言っていましたが、何故なのか分かりません。
あとクラス全体がこのような結果になったことを、溶液I(Tris, EDTA, RNase グルコース)が上手く働かなかったためと言っていたのですが、それだけの説明ではいまいち、理解しきれません。
何方かわかる方いらっしゃいましたら、分かりやすく教えていただけないでしょうか。
よろしくお願いします。
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
この辺、あんまり気にしたことがないので
以下の説明も間違ってるかもしれませんが、
テキストなどを読み疑いつつ参考にしてください。
> アガロースゲル電気泳動の結果が普通だったら、
> オープンサーキュラー、リニアー、スーパーコイルと出てくるはずが
> スーパーコイルとRNAしか出ませんでした。
> 先生はそれは、いいことだと言っていましたが、何故なのか分かりません。
プラスミドは二本鎖の環状構造なのはご存知ですね。
それはスーパーコイルの構造をとっているのが普通です。
これは、二重らせんが環を巻くとき捻れが生じるので、
その捻れの歪みを解消するために全体が別のらせんを
作るとエネルギー的に安定だったからだと思います。
じゃあオープンサーキュラーとリニアーはなぜ生じるか?
リニアーは簡単で、二本鎖ともどこかでぶっちぎれたものです。
なので単なる直鎖になります。
オープンサーキュラーはスーパーコイルとリニアーの丁度中間で、
二本鎖のうち一本の鎖がどこかで切れるとオープンサーキュラーになります。
ちょうど二本のゴムをよじってよじってよじっていった後で、
一本だけ切断すると歪みが解消されるのと同じような感じです。
(この一本差の切断部分は「ニック」と呼ばれます。)
じゃあ先生はなぜ「それは、いいことだ」と言ったのか。
もうおわかりの通り、得られたプラスミドには
切断された箇所もニックも存在しなかったからです。
綺麗なプラスミドが得られたので「いいことだ」とおっしゃったのでしょう。
> あとクラス全体がこのような結果になったことを、
> 溶液I(Tris, EDTA, RNase グルコース)が
> 上手く働かなかったためと言っていたのですが、
> それだけの説明ではいまいち、理解しきれません。
プラスミドを精製するときは、RNAが不純物として混ざらないよう
RNase(RNA分解酵素)で大腸菌内のRNAを分解します。
おそらくこのRNaseの効きが悪かったために
クラス全員のプラスミドにRNAが混ざってきてしまったのでしょう。
おそらくそういうことを言ってるのではないかとおもいます。
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