制限酵素の消化

制限酵素でラムダDNAを切断したいのですが、上手くいきません。アドバイスをお願いします。

基質DNA：ラムダDNAのPCR産物
制限酵素：PstI(約1U)
反応時間：37度　1時間

基質DNAのPCR産物は約6000bpで、本来であれば、2000、1400、1300、1100、160、72bpの6つに切断されるはずなのですが、電気泳動して確認したところ短いフラグメントの160、72bpというのが見えません。何故でしょうか？

No.1 回答者： knightgold 回答日時： 2001/07/17 19:17

　まず始めに、非常に昔の事ですので色々と間違っていたらごめんなさい。

　
　まず、λＤＮＡって電気泳動で指標になるマーカーですよね。
　これをこの様に作っているのですか？（すみません質問で返して）
　
　とっさに思いついたのは、流れきっているということは有りまんか？
　短いのは早く流れますので、電気泳動の時間が長いとゲルから出でって
　しまうと思うんですが。
　もし、マーカーと同時に流していて、マーカーの断片は残っているが、
　切断した断片が無いとしたら、まあ電気泳動の時間は良い事になりますから、
　考えられるのは、違う部位で切れているかですよね。

　もし上記（電気泳動の時間）で違う様でしたら、以下補足下さい。
　１　λＤＮＡは市販ですか、独自に作成したものですか？
　２　PstIの切れ方はどのような方法で切れましたっけ？
　　　平滑末端　付着末端ですか？
　３　反応時間は1時間で宜しいですか？
　４　これは興味本位ですが、学生実験ですか？マーカーをこの方法で
　　　作っているんでしょうか？
　　教えて下さい。

この回答への補足

補足させていただきます。
1　ラムダDNAは市販のものです。その一部約6000bpをPCRによって増幅しました。
2　PstIは付着末端で切れます。
3　反応時間については、お伺いしたかったうちの1つです。1時間ぐらいでいいのでしょうか？とりあえず、1時間で実験をしてみたのではっきりとはわかりません。
(すいません・・・)
4　学生実験でマーカーを作っているわけではありません。が学生です。

それと、電気泳動のときに流しすぎたのでは？ということでしたが、それは無いと思います。なぜなら、切断断片を確認するときにマーカーを流しましたが、マーカーのバンド(最小80bp)も確認できましたので、流しすぎでは無いと思います。
よろしく御願い致します。

補足日時：2001/07/17 19:33

No.2 回答者： knightgold 回答日時： 2001/07/18 08:37

　補足頂きありがとうございます。

ここからは私の推測になってしいますのでご容赦下さい。

　１　ＰＣＲ産物の確認と回収は行われていますでしょうか？
　　　もとのＤＮＡは市販のものですからほとんど疑う余地は無いですが、
　　　ＰＣＲ産物を回収していると他のものコンタミも考えられますので、
　　　正確に回収できているか確認下さい。

　２　制限酵素もしくは他の物質のコンタミ
　　　　学生実験などで良くある失敗ですが、他の制限酵素が混じっている
　　　場合や余分な物質が含まれている場合に上手く実験が出来ない事も
　　　有りますので、疑うとしたら、PstIの制限酵素か、ＤＮＡ回収時の
　　　持ちこみを考えてください。切れていない事も考えられます。

　３　反応時間の長さ
　　　　付着末端ではあまり無いと思いますが、平滑末端だと、酵素の失活後
　　　再度付着も考えられると思います。
　　　　ただ、反応時間がこれで良いか定かでは無いですので確認した方が
　　　良いと思います。
　　　　λＤＮＡのマーカーで流すのも良いと思います。切れてなくて、
　　　長い状態のＤＮＡがあるかもしれません。

　４　あとこの酵素の基本的な内容を確認するのも必要かもしれません。
　　　たとえば、ある伸長以下のものは切れないとかです。

　　回答になっていませんが、アドバイスになれば幸いです。

この回答へのお礼

＞回答になっていませんが、アドバイスになれば幸いです。
いえいえとんでもないです。アドバイスありがとうございます。

メーカー(制限酵素販売)に問い合わせてみましたが、酵素のユニット数や、反応時間を長くするということを対策として言われました。
もう少し、実験をしてみます。

お礼ではなくて報告みたいになってしまって申し訳ありません。

お礼日時：2001/07/18 16:02

No.3 回答者： akiyamaharuka 回答日時： 2001/07/18 12:22

すでにお考えのこともあるかもしれませんけど。

反応時間は少し短いような気がします。
パーシャルになっていて見えないのかも知れません。
貧乏だったころ自分でマーカーを作っていたのですが、オーバーナイトできってました。

酵素をふやすのもありかもしれません。あとDNAが変なコンフォメーションをとっているかも知れないので、反応前に少し温度を高くして高次構造をほぐすと良いかもしれません。これはあまり期待できませんけど。

あと、流す量が少ないなんてことはありませんよね。上のバンドの量からしてしたのバンドは確認できる量なのですよね。

あとコントロールとしてラムダDNAの自体をダイジェストして流したらどうでしょう？おんなじところにバンド出ますよね多分。
どんな切れ方をするかわかりませんが、ちょうどそこにエラーがあれば切れませんよね。

思いつくままで申し訳ないですが、こんなところです。

この回答へのお礼

アドバイスありがとうございます。
やはり気になるのは反応時間ですね。オーバーナイトで一度試してみます。

お礼日時：2001/07/18 16:39

No.4 回答者： taketaketakeo 回答日時： 2001/07/20 02:00

いろいろと原因が考えられますが、

　反応時間やユニット数は本来ならばほとんど関係ないとおもいます。酵素の活性が落ちているのでは？もしそうならば反応時間やユニット数を増やすのも手です。ただしあまり酵素の含有率を多くするのもよくないそうですので全反応液の10分の１までにしておきましょう。
　他に考えられるものとしてＰＣＲがうまくいっていないことが考えられるのでは？ＰＣＲ後バンド確認しましたか？プライマーが間違いなくともうまく増幅されないこともたまにあります。Taqの種類によってはエラーが多くなってしましますし。
　最後に。多分これが一番確率が高いと思うんですが、小さいＤＮＡ断片はなぜだか知らないのですがよくバンドが見えないものです。電気泳動するＤＮＡの量をもと増やしてみてはどうですか？
とまあもっとも？らしくアドバイスしているんですが実は私は研究かけだしの4回生。実験って思ったよりうまくいかなくて先に進まないものですね。うまくいくはずのことがうまくいかないときのやるせなさ・・・お互い頑張りましょう。

No.5 ベストアンサー 回答者： keitaro1968 回答日時： 2001/07/21 09:30

こんにちは、

taketaketakeoさんの指摘に補足します。
エチブロで染色して確認してますよね。エチブロの発光強度は
DNAの塩基の量に比例します。そのため、2000～1100bpのは
見えても、160、72は見えないのではないでしょうか。
（例えばカタログに乗っているλ/hindIIIの泳動写真とかも
低分子量のフラグメントの発光強度が小さくなってませんか）
ロードする量を多くして、低分子量を分けるのに最適化した
ゲルで泳動して確認されたらいかがでしょうか。