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今度,PCRから電気泳動をしようと考えているのですが
皆さんは希釈,及び作成した
TAE,ローディングバッファー,アガロースゲルを
どのくらいの期間を基準に新たに作成しているので
しょうか?
御意見宜しくお願いします.
またそれらに関して参考文献などがありましたら
宜しくお願いします.

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A 回答 (4件)

私はこんな風にしています。

今までいたいくつかのラボでも、みんなこういう感じでした、

ローディングバッファー:ふだん使っている分は、エッペンチューブに入れて、使い切るまで室温で保存(ベンチトップに常備)。最近はSDS入りのものが一般的だと思いますが、これならまず腐りません。逆に、冷蔵保存するとSDSが析出して厄介です。ストックは冷凍保存しておけば半永久的に保ちます。

TAE:50xのストック溶液は、オートクレーブをかけ、室温、または冷蔵で無期限保存。1xTAEは、5-10 LのタンクにmilliQ水で希釈して作り、使い切るまで室温保存(非滅菌)。日常的にフラグメントのチェックなどに使う分には、泳動槽に入れっぱなしのバッファーを使い回す。蒸発して減った分は蒸留水で補う(目分量)。TAEで補ってしまうとだんだん濃度が高くなり、過剰な電流がながれ、過熱したりフューズが切れたりする。ここ一番の泳動のとき(論文データとして使う可能性があるとか)、切り出しをするとき、サザンハイブリをするときを機会にして、新しいTAEに換える。

アガロースゲル:型ごとタッパーに入れ、蒸留水を少々かけ(タッパーの底にも少々)密閉して冷蔵保存。1ヶ月は楽勝で保ちます。私は、アガロースを溶解するのに、急がないときはオートクレーブを使うのですが、そのせいか、この状態で室温保存しても数ヶ月保っています。それでもやっぱり、ここ一番のときは、新しいのを作るんですが。
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私がいた研究室の場合ですが



TAE
50×TAEはオートクレーブした後室温保存。
使い切りで大体2ヶ月くらい使った。
※私は実験の都合上1M Tris-HCl(pH8)、0.5M EDTA(pH8)を別途持っていたのでそれを使用して1×TAEを作ってました。いずれもオートクレーブ後室温保存。2ヶ月くらいで使い切り(単にその頃なくなるだけでもっと持つとは思います)。
泳動バッファーはBPBの青色が目立ってきたら替えた。あとは泳動後切り出すとかするときは必ず替えた。

ローディングバッファー
冷凍保存。1ml程度なら室温に置けばすぐに溶けるので。使い終わったらまた冷凍。最後まで使い切り。

アガロースゲル
ラップをかけて冷蔵庫で1週間くらい。
縮んだりするし、頻繁に使うのでそもそも長期保存する間もなく無くなった気がする。
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TAEのx50 stockは室温長期間保存可能なので無くなりそうになったら暇な人が暇な時に3L位作っています。


LoadingBufferは制限酵素とかマーカー買った時についてくる(10xとか6xの)奴で室温で保存。
アガロースゲルは1L位のビンに500ml程度作って、使うときに適時レンジでチン、足りなく少なくなったら足していきます。密閉できるビンでないと乾燥して濃度が変化してしまうので注意。基本的には型に流した状態では保存していません、穴開きませんかw?
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TAEに関しては50×でstockを作成して、使用しています。

stockは長期間(1年以上)保存しても問題ありません。LoadingBufferは、制限酵素などに添付されている物を使用しているのですが、これもかなり長期間使用できます。アガロースゲルについては、私は要事調整で作成しているのですが、作り置きする場合は長くても4℃で1~2週間以内に使用した方がいいと思います。(カビが生えるおそれがあるので)
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従って、水のなかで長期保存した場合、分解します。
長期保存する場合は、緩衝液(TE)などに保存することが必要です。
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Aベストアンサー

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Aベストアンサー

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エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
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すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

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Q電気泳動のスメアバンド

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Aベストアンサー

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
この中での二本鎖の核酸成分は増幅産物・テンプレートDNA・テンプレート中のRNAが二本鎖を形成したもの、プライマー同士が反応したプライマーダマーです。RNAやプライマーダマーは一般的に低分子領域にスメアとして現れます。また、PCR反応液にテンプレートを入れすぎるとこれもまた電気泳動上に現れます。サンプルの状態によってはスメア状に出ることもあります。
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エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
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Qエタ沈後のペレットを確実に溶解させるには

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エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

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Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

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沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
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QDNAを室温放置はまずい?

DNAは実験終了後室温、実験台で放置しておくと
どれくらいで駄目になりますか?
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全然使えるのですが。

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Aベストアンサー

 室温でも簡単には壊れないと思いますが、冷蔵庫か冷凍庫に保管したほうが良いです。
 なぜか、
 DNaseのコンタミ、カビのコンタミ(nucleaseを作る)などがあった場合、室温だと、どんどんDNAが壊れてしまいますが、低温だとそのリスクが低減できます。また、室温だと、水分が蒸発して、濃度が変わるかもしれません。
 いままで、問題なくても、明日、DNAは壊れているかもしれません。少しでも、DNAが壊れるリスクにはさらさないほうが良いです。
 私は、フリーザーに保存しています。

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鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり
たくさんないので、増やす事もままなりません。
他に何か良い方法があったら教えて下さい。

Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。

例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか??

Aベストアンサー

いちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした2ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。


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