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植物のゲノムDNAの抽出を行っています。
ところが、最後のエタ沈の段階でDNAがゲル化し、
溶けにくくなって困っています。
(濃度の高いDNA溶液を作りたいため)
方法はCTAB、SDS共試してみましたが、同じようにゲル化してしまいました。
何かいい方法はないでしょうか?

A 回答 (3件)

ゲル化しているのは、主に多糖類ですね。


うまくいくとは保証できませんが、いくつかヒントを、
1.ゲル化した多糖類より核酸は溶けやすいので、遠心して不溶性のゲルを除き上澄みだけ回収する。

2.沈殿を十分量のTEに溶かし、多糖類が十分に取り除けるまで、再びCTAB/NaCl沈殿を繰り返す。

3.沈殿をを十分量のTEに溶かし、多糖類が十分に取り除けるまでフェノール抽出を繰り返す(多糖類を除くのには、クロロフォルムを含まないバッファ飽和のフェノールを使うほうが効果的です)。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます!
早速試してみます。

お礼日時:2005/07/14 15:04

>一見解けたのですが、粘性が高くて扱いづらいので困ってしまいます。



ゲノムDNAのように高分子のDNAを、高濃度で溶かせば、粘性が高くなるのはごく当たり前のことです。マイクロピペットで扱うときは、市販の穴のサイズが大きいチップか、先を切ったチップを使うといいでしょう。濃度ムラもあり正確に定量できない場合もあることは考えに入れておいてください。
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この回答へのお礼

分かりました。気をつけます。ありがとうございます。

お礼日時:2005/07/22 13:37

DNA量が多い時にはゲノムDNA、プラスミドを問わず


エタチン後にゲル状化するのは仕方ないと思っています。

TEなどをいれて4℃で一晩くらい静置しても溶けませんか?
ローテーターがあればそれでゆっくり回したほうがより溶けやすいと思います。
溶ける前に先端を切って穴を広げたチップでピペッティングする人もいますが、
ゲノムDNAの場合は切れると困る場合があるので私はやりません。

入れたバッファーを含めた全体がゲル状化するのであれば、
もっと薄めるか、そのままよく混ぜて濃度を測って使うしかないと思います。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます!
4度で一晩静置してみました。
一見解けたのですが、粘性が高くて扱いづらいので
困ってしまいます。

お礼日時:2005/07/14 15:03

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Qエタ沈後のペレットを確実に溶解させるには

プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真...続きを読む

Q非動化の目的を教えて下さい。

非動化の目的を教えて下さい。

あまりしっかり把握できていないので詳しく教えて下さい。
血清などを”非動化する目的”は何でしょうか。

もうひとつ、非動化と言わず”不活化”という場合もありますが
この2つは同じ意味でしょうか。


初歩的な質問ですみません。
宜しくお願いします!

Aベストアンサー

非「働」化ですね。inactivationの訳語ですので、不活化、不活性化でもいいはずですが、なぜか特定の場面に限り不働化という用語があります。

血清に含まれる補体群を、他の成分(成長因子、免疫グロブリンなど)を失活させないように56℃程度の温和な熱処理によって、不活性化することです。補体は細胞障害性などの生理活性があるので、それを排除したいときに行います(たとえば細胞培養に使うときなど。それでも最近は、可能であれば(とくに影響がないかぎり)非働化処理はしないほうがいいという記述も多い)。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

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もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Qマルキス試薬について

芳香族炭化水素(トルエンなど)の存在を確認するための試薬としてマルキス試薬があります。
これは硫酸とホルマリンの混合液とのことですが、トルエンなどと反応し呈色するそうですが、反応機構はどうなっているのでしょうか?ホルマリンとトルエンが反応し着色する物質ができていると思うのですが、詳しく教えてください。

Aベストアンサー

トルエン+ホルムアルデヒド+硫酸での生成物では呈色の要因となる共役系
の延長は起こらないように思えますので、私もNo.1の方と同じく、この条件での
呈色には疑問を抱きます。

ただ、Webで検索したところ、「改良マルキス試薬」によってトルエンの検出が
可能であるらしい記述がありました(講演プログラムの1項目としてだけですが)。
http://wwwsoc.nii.ac.jp/jsac/nenkai53/53rd%20main.html
(「P3066」の項。キーボードのCtrlキーとFキーを押して「改良マルキス試薬」で
 検索して下さい)

この『改良』が「ホルムアルデヒド」の「ベンズアルデヒド誘導体」への置き換え
であれば、トルエン2分子と脱水縮合すればトリフェニルメタン誘導体が生成する
ことになります(但し、この反応が容易に起こるのかは・・・何とも言えません(汗))。
これであれば、ベンズアルデヒド誘導体の構造によっては共役系の延長が
起こり得るので、呈色の可能性はあると思います。

例えばp-位にアミノ基があれば、下記URLで説明されているメチルバイオレット
と同様の構造変化により2つの環が共役する為、吸収帯が長波方向にシフトし、
呈色することも考えられます
http://www.kiriya-chem.co.jp/q&a/shijiyaku.html

トルエン+ホルムアルデヒド+硫酸での生成物では呈色の要因となる共役系
の延長は起こらないように思えますので、私もNo.1の方と同じく、この条件での
呈色には疑問を抱きます。

ただ、Webで検索したところ、「改良マルキス試薬」によってトルエンの検出が
可能であるらしい記述がありました(講演プログラムの1項目としてだけですが)。
http://wwwsoc.nii.ac.jp/jsac/nenkai53/53rd%20main.html
(「P3066」の項。キーボードのCtrlキーとFキーを押して「改良マルキス試薬」で
 検索して下さい)

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Q菌数?コロニー数?

エアクリーナーを使用中の室内で、浮遊菌数を測定するためにエアサンプラーを用い測定を行う予定です。
初歩的なんですが、菌数と、コロニー数はどう違うのでしょうか?
教えてください。

Aベストアンサー

「菌数」とは,呼んで字のごとく菌の数のことです。その「菌数」を数える手だてとして,菌を培養して「コロニー数」を数える方法(「平板培養法」や「混釈培養法」)があるわけです。
ですから,培養法での検査結果としては「菌数=コロニー数」と考えてしまってかまわないと思います。

ですが厳密には・・・
1.コロニー数は生菌の数のみを反映するので,死菌を含めた「総菌数」とは大きく異なる。
2.生菌1個が,必ずしも肉眼で確認できるコロニーになるまで増殖するとは限らない。
3.菌体が集塊状になりやすい菌は,複数個の菌で1個のコロニーを作りうる。
・・・などの理由で「菌数≠コロニー数」になるのでご注意ください。


言葉の正確性を期すのであれば,菌数の単位を「CFU(colony forming unit:コロニー形成単位)」と表現すればよいと思います。
1CFUとは「1個のコロニーを作るだけの菌量」ということです。

つまり,1m3あたりの菌数を培養法で測定した場合,結果を
「○○CFU/m3」
とすれば学術的にも正しい表記となります。

「菌数」とは,呼んで字のごとく菌の数のことです。その「菌数」を数える手だてとして,菌を培養して「コロニー数」を数える方法(「平板培養法」や「混釈培養法」)があるわけです。
ですから,培養法での検査結果としては「菌数=コロニー数」と考えてしまってかまわないと思います。

ですが厳密には・・・
1.コロニー数は生菌の数のみを反映するので,死菌を含めた「総菌数」とは大きく異なる。
2.生菌1個が,必ずしも肉眼で確認できるコロニーになるまで増殖するとは限らない。
3.菌体が集塊状...続きを読む

Q抗体価って何ですか?

抗体価って何ですか?高一にも分かるぐらい簡単な説明お願いします。

Aベストアンサー

例をヒトとします。ヒトの体の中には沢山の種類の抗体があります。
その中で、あるウイルスに反応する抗体はその中の一部です。
では、沢山ある抗体のうちのどの位、そのウイルスに反応する抗体が存在しているのか?
それを示す目安の値(あくまで目安)が抗体価です。
この抗体価が高いと、そのウイルスに対する抗体が沢山あることになります。抗体価が低いとその逆です。

ヒトなどの体内にある抗体に限らず、ある抗体の集団のなかで、
あるモノにくっつくことができる抗体の量を示す目安の値です。

Q物理化学の実験のレポートについての質問です。

物理化学の実験のレポートについての質問です。

反応速度についての実験をしているんですが、考察でわからないところがあります(汗

まず、反応速度のところなんですが、酢酸エチルの加水分解反応の反応速度を測定して速度定数を求めるという実験です。25℃、30℃、35℃、45℃において、それぞれ0分から90分まで反応させて、その後NaOHで滴定して滴定量を出して、滴定量と時間から、速度定数kを計算で求めるのと、横軸に時間を、縦軸にlogCをとって、その直線式の傾きに-2.303を掛けてだすkの二つについて考察せよ

というものです

(読みにくくてすみません)

あとひとつあります(>_<

上の場合の活性化エネルギーについてなのですが、

logk = lnA - Ea/2.303RT
をつかって活性化エネルギーEaを出して、また、縦軸にlnk、横軸に1/Tをとって、傾きから活性化エネルギーを求めて、それについて考察するというものです。

計算で求めるときに、頻度因子であるAは何をいれたらいいのでしょうか??

あと、考察とはどのようなことを書いたらいいでしょうか(;_;

物理苦手で全然わかりません…


本当によろしくお願いしますm(__)m

物理化学の実験のレポートについての質問です。

反応速度についての実験をしているんですが、考察でわからないところがあります(汗

まず、反応速度のところなんですが、酢酸エチルの加水分解反応の反応速度を測定して速度定数を求めるという実験です。25℃、30℃、35℃、45℃において、それぞれ0分から90分まで反応させて、その後NaOHで滴定して滴定量を出して、滴定量と時間から、速度定数kを計算で求めるのと、横軸に時間を、縦軸にlogCをとって、その直線式の傾きに-2.303を掛けてだすkの二つについて考察...続きを読む

Aベストアンサー

一次反応だと酢酸エチルの濃度をCとして
-dC/dt=kC...(1)
となり、これを解いて
C=Co*exp(-kt)...(2)
となります。Coは初期の濃度です。この式は
ln(C/Co)=-kt...(3)
あるいは常用対数を用いて
2.303log(C/Co)=-kt...(3)'
です。だから原理的にはk=-2.303log(C/Co)でkを計算すると(同じ温度であれば)全ての時刻tでkは同じ数字になるはずです。しかし実際にはそうはなりません。測定のバラツキはもとより、kに系統誤差を含んでいることさえありえます。それはt=0がどの程度正確か、Coがどの程度正確かによります。これについてグラフ作成で考えて見ます。(3)'は
logC=-(k/2.303)t+logCo...(4)
ですから、tに対してlogCをプロットすれば勾配が-k/2.303、y切片がlogCoの直線を得るはずです。ここでtとはt=0からの時間です。このtに曖昧さがあったとし、更にCo濃度も測定誤差を含んでいたとします。でもそれはy切片の値に繰り込まれて、勾配である-k/2.303には影響しません。Excelで解析すれば最小二乗法で得られた直線の上下への測定点のバラツキから、これから得られた勾配の精度がでるはずです。
逆に各時刻でのCから(3)'式を使ってkを算出する場合はCoとtは誤差を含んだある値がそのまま使われます。たとえばtがいつもΔtだけずれていたとしたら出てくるkは真のkでなく
k=-{2.303log(C/Co)}/t...(3)"
の代わりに
k'=-{2.303log(C/Co)}/(t+Δt)...(5)
となります。tが大きいと同じ値に近づきますが、tが小さくてΔtを無視できないとし、Δt>0の場合初期はk'が小さくなります。
同じくCoに誤差があるとき、
k"=-2.303log(C/(Co+ΔCo))/t...(6)
になります。この場合は例えばΔCo>0ならばk"は常に小さめの値になります。
(3)"からkを直接計算した結果の動向と、グラフの勾配から出したkの結果を見比べて考えてください。

活性化エネルギーは
k=A*exp(-E/RT)
より
lnk=lnA-E/RT
あるいは
logk=logA-E/(2.303RT)...(7)
から出しますがkの数字は出ています。それから温度Tがわかっています。だから1/Tに対してlogkをプロットすることはできるはずです。その勾配が-E/2.303Rになっています。
Aは逆に(7)のグラフのy切片(1/T=0)から求まります。

一次反応だと酢酸エチルの濃度をCとして
-dC/dt=kC...(1)
となり、これを解いて
C=Co*exp(-kt)...(2)
となります。Coは初期の濃度です。この式は
ln(C/Co)=-kt...(3)
あるいは常用対数を用いて
2.303log(C/Co)=-kt...(3)'
です。だから原理的にはk=-2.303log(C/Co)でkを計算すると(同じ温度であれば)全ての時刻tでkは同じ数字になるはずです。しかし実際にはそうはなりません。測定のバラツキはもとより、kに系統誤差を含んでいることさえありえます。それはt=0がどの程度正確か、Coがどの程度正確かによります...続きを読む

Q多糖類の多い植物からのDNA抽出法。

多糖類が多い植物からのDNAの抽出は何かポイントがあるのでしょうか?
フェノール・クロロホルム抽出の繰り返しなどではだめでした。
フェノール法やCTAB法も定法ではだめで、エタノール沈殿が
終わったときにはペレットになっていても、それをTEに溶かすと、
粘性がでてしまい、吸光度も260nm付近にピークが来ません。
(できれば超遠心は使いたくないのですが・・・。)

バッファーを暖めておくといい、等、裏技的な手法でもかまいません。
単離したDNAはサザンブロットに用いるグレードでとれればいいです。
どなたかご存じの方いらっしゃいましたら、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

経験者といってもぺーぺーの4年なのですが、同じようなことしてます。
DNA抽出はCTAB法を用いますが、その前にサンプルを洗浄してます。
粉末にしたサンプルに以下の洗浄bufferを加え遠心分離→上清を捨てる。
これを上清の粘りけがなくなるまで繰り返します。その後はそのままCTABへ
(CTAB溶液は65℃でやってます)

洗浄bufferの組成
 0.1M HEPES (NaOHでpH8.0に調整)←0.1M Tris-HCl,pH8.0で代用可?
 0.1% ポリビニルピロリドン
  4% 2-メルカプトエタノール
 D.W

基本的なことのようで、もしかすると既になさっているかもしれませんが、お役に立てたら幸いです。

もうひとつ、得られた沈殿を0.1M(pH6.0)の酢酸ナトリウムに完全に溶かし、ゆっくりと1/10量のエタノールを加えると多糖類だけが析出。これを遠心分離し上清をエタ沈。という方法があるようです。ただ実際やったことがあるわけではないので少々無責任な発言となります。

Qドラーゲンドルフ試液と第三アミンの反応について

塩酸ジフェンヒドラミンがドラーゲンドルフ試液と反応し、橙色の沈殿物を生じるというのが、具体的にどういう反応で起こっているのか(化学式で)知りたいのですが、調べても分かりませんでした。

ドラーゲンドルフ試液が第三アミンとだけ反応する所まで位しか分かりませんでした。

どういう反応が起こっているのか、ご存じの方、教えて下さい。
orどこら辺のweb or 書籍を調べれば良いのか是非教えて下さい。
よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

rei00 です。

 gumi_gumi さんの「ジフェンヒドラミン・ワレリル尿素散」と「ジフェンヒドラミン・フェノール・亜鉛華リニメント」について,「第十一改正 日本薬局方解説書」(廣川書店)で見ました。確かに両者の確認試験として出ていますが,反応式までは無いですね。

 なお,ドラーゲンドルフ試薬はアルカロイドの検出試薬として有名ですが,必ずしもアルカロイドには限りません。含窒素化合物であれば反応するといえます。「ジフェンヒドラミン」も三級アミンを持ちますから呈色します。

 また,色や濃さは異なりますが,窒素を持たない含酸素化合物でも呈色する事があります。こちらはあまり知られていないようで,学生が時々勘違いします。

Q酵素活性とDTT

こんにちは。お世話になります。

ある酵素の活性を評価しているのですが、プロトコールにはDTTを入れることになっています。

1.酵素活性におけるDTTの役割は何なのでしょうか?

2.DTT入りのbufferを2週間ほど冷蔵保存して使用したところ思うような酵素活性が得られませんでした。DTTは一般に用時調製するものなのでしょうか?

3.仮に用時調製するにしても毎回微量を秤量するのは効率的ではありません。DTTの濃いstock溶液をつくり一定期間使用することは可能でしょうか?その場合、溶媒、保存方法はどうすればよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

1.酸化防止です。基本的なことですからタンパク精製の本にあると思います。ベータメルカプトエタノールも同様な働きです。

2.用事添加が基本です。察するに酸化に弱い酵素なのでしょうね。

3.1Mのストックで私は使用してます。比較的に安定です。ファイナルで1mMほどで使うことが多いので千分の一加えることになります。この場合は水で溶かせば問題ないです。別にバッファーでも問題はないと思いますけど。
使用期間ですが、実験の精度や酵素の性質によるので何ともいえません。10mlも作って分注して試されたらよろしいかと思います。


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