文献に in situ closed-loop method という言葉がありました。インターネットで調べても、イマイチよくわかりません。どういう方法なのか教えてください。薬学に関する文献です。

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A 回答 (1件)

情報不足で分かりませんが、以下の参考URLサイトは参考になりますでしょうか?


「C3-2 コンピュータを用いたクローズドループ薬剤投与システム」

この例のように、薬剤濃度等の目的とするパラメーターをモニターしながら・・・?

in vivoの系でしょうか?
可能であれば、PubMedでAbst.を見れるのであれば、論文名を紹介下さい。

補足お願いします。

参考URL:http://www.anesth.or.jp/kako/masui48/docs/abstra …
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Qin situ probeの作り方

in situ 用のRNA probe作製についての質問です。

現在行っているprobe作製の手順ですが、
(1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。
(2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。
(3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。

この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。
DNAのコンタミかと考え、in vitro transcriptionの試薬を新しくし、再試行しましたが、同じ結果となりました。
どのようにしたらこの問題を解消できるのでしょうか。

in vitro transcriptionの前にgel extractionによりPCR産物は精製しているので、全く異なる配列のRNA産物ではないと思うのですが、このままin situに使えますか?
もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。
よろしくお願いします。

in situ 用のRNA probe作製についての質問です。

現在行っているprobe作製の手順ですが、
(1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。
(2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。
(3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。

この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。
DNAのコ...続きを読む

Aベストアンサー

>PCR産物を各制限酵素で処理すればよいでしょうか。
末端に適当な制限酵素認識配列があればそれが簡単ですね。
T4 DNA polymeraseでbluntingするという手もあります。

予想外のバンドのサイズは、本来よりも大きいのでしょうか小さいのでしょうか。小さい場合、単純にRNA合成が途中で止まっているだけかもしれません。
鋳型のコンタミかどうかは、なににせよ合成産物なのかは、泳動後、メンブレンにブロットしてラベルの検出法に従って検出してみればわかるでしょう。

RNA polでの合成は、特に化学修飾のラベルがついた基質では、なかなか完全長の産物は出来ないものですし、泳動で見るとへんな結果になることもありがちです。それでも、実用上は問題のないことも多いです。

>もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。

私は、出来たプローブでNorthern blotをやってみて、目的のRNAが検出でき、それ以外は検出されないかどうか確かめます。
同じ遺伝子でも鋳型に選ぶ場所によって、うまくいったりいかなかったりしますし、Negative controlのsense probe中にantisenseが出来ていたりすることがあるので、事前にちゃんとworkするか調べておくのは、電気泳動でサイズを見るより役に立ちます。

>PCR産物を各制限酵素で処理すればよいでしょうか。
末端に適当な制限酵素認識配列があればそれが簡単ですね。
T4 DNA polymeraseでbluntingするという手もあります。

予想外のバンドのサイズは、本来よりも大きいのでしょうか小さいのでしょうか。小さい場合、単純にRNA合成が途中で止まっているだけかもしれません。
鋳型のコンタミかどうかは、なににせよ合成産物なのかは、泳動後、メンブレンにブロットしてラベルの検出法に従って検出してみればわかるでしょう。

RNA polでの合成は、特に化学修飾...続きを読む

Q外来遺伝子のin situ ハイブリダイゼーション

外来の遺伝子の発現を調べるのに、遺伝子につけたHAやFLAGなどのタグを含むプローブというのは使えますか?
内在の遺伝子と区別したい場合、普通は配列の違う別の種の遺伝子を使って、in situ ハイブリダイゼーションをするのでしょうか?

Aベストアンサー

マウスの事情はよく知らないのですが、、、
私の取り扱っている材料では、ホールマウントで、ISHも抗体染色もごく普通にやられています(マウスに比べればすっと小さいですが)。
実際のところ、核酸プローブの方が浸透しにくいです。ISHでは、プローブの浸透性をよくするため、標本の前処理(プロテアーゼ、界面活性剤、DMSOなど)は不可欠で、プローブの鎖長も長くなりすぎないように調整したりします。抗体染色では、そういうこといっさいなしです(まあ、あれば、Fabフラグメントのほうがいいかなあ、くらいです)。
おそらく、マウスでもホールマウントISHの検出は酵素標識抗体を使うと思うのですが、同じことではないでしょうか。

Qin situ のプローブについて

antisense probeと sense probeはどのように区別されるのでしょうか?
例えば、T7プロモーターの下流に遺伝子配列が組み込まれている場合、T7 RNA polymeraseでは、どちらのプローブが合成されるのでしょうか?

Aベストアンサー

anti-sense probeは、mRNAの相補配列でmRNAと二重鎖を形成できます。
sense probeは、mRNAと同じ配列ですのでmRNAと二重鎖を形成することが
できません。

T7プロモータの下流に遺伝子が正方向に組み込まれていれば、
T7 RNA polymeraseでmRNAと同じ配列が転写されますから、
sense probeが合成されるということになります。

T7 RNA polymeraseでanti-sense probeを合成したければ、
遺伝子を逆方向に組み込む必要があります。

ちなみにですが、
元々anti-senseとsenseは、DNAの二本鎖を区別する名称で、sense鎖(+鎖)は、
TをUに変換するとコドンの並び(=mRNA配列)になるので、「意味のある配列」
と言う意味で命名されたものです。

QWhole mount In situ ハイブリダイゼーションについて

Whole mount in situ ハイブリダイゼーションとはどのような手法ですか?方法や原理など分かる方教えてください。

Aベストアンサー

普通、in situハイブリといえば組織の切片を使いますが、Wholeではひとつの組織、あるいは胎児などに、クローニングした目的遺伝子のmRNAに標識をつけてしみこませ、その後、発色するなり発光するなりして検出することで、どの組織に目的遺伝子が発現しているかを確認できます。

参考URL:http://www.gtca.kumamoto-u.ac.jp/info/GAIYOU/in-situ.html

QIn situ real time PCRとは?

In situ real time PCRというものを論文で見つけたのですが、これはいったいどういう技術なのでしょうか?
In situ PCRで特異配列を増幅させてそれをプローブで検出するのならば分かりやすいのですが、どうしてそれとreal timeを組み合わせる事が出来るのでしょうか。
私はreal time PCRは遺伝子発現量を調べるためのものだと思っているのですが、それを組織切片で出来るということでしょうか?いまいち想像が出来ません。
どなたかご教授願えませんか?
(ちなみにその論文はアブストしか読めなかったので手技的なことは分かりませんでした)

Aベストアンサー

レーザーマイクロダイセクション法で回収した組織でreal time PCRをかける事でしょうかね?もとのabstがわかればもっとはっきりするのですが。


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