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プライマーデザインをしなければいけないのですが、どのようなステップを踏んでいったら良いのでしょうか?

A 回答 (5件)

本が手に入らない環境にいらっしゃるとは思いませんでしたので失礼しました。



皆様のアドバイスで上手くいくと思いますよ。
プラスミドからつるのはそんなに難しくないですから。
問題はプライマーの設計もありますが、PCRの条件も効いてきます。
条件の勉強も同時にされると良いでしょう。
PCRは距離が長くなると格段に難しくなります。はじめてなら余りロングは止めた方が良いでしょう。頑張って見てください。

気がついたことを少し。
Tm値もきをつけましょう。簡易としてGC4度、AT2度で考えれば良いです。
60度ぐらいが良いでしょう。この時センス鎖とアンチセンス鎖のTmがあまり違いすぎると上手くかからないことがあります(片側PCRになる)。気をつけてください。
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この回答へのお礼

普通日本に居ないなんて思いませんよね。色々迷惑かけてすみません。また、アドバイス有難うございます。参考になります。

お礼日時:2001/01/30 12:03

最初の回答への「お礼」を見たところ、書籍の入手が困難ということでしたので、ポイントをかいつまんでアドバイス差し上げます。



clownさんのプライマー決定法で基本的なところは押さえられると思いますが、さらに収率のよいプライマーを作るためには、プライマー自体を

・GGGG配列を含まない
・プライマーダイマーを作らない
・プライマー自体がヘアピン構造を作らない
・プライマー開始端(3'端)はATを多く、終止端(5'端)はCGを多く、最終端(5'末端)はAもしくはT

に作成するということもできます。
これらのテクニックについては、ペーパー(論文?)がでてます。(ごめんなさい、今手元にありませんので詳細がわかりません)

あまりにも条件が複雑になりすぎると、手で作成するには困難になりますので、clownさんのおっしゃった方法でよい結果が得られない場合に利用してみてください。

一番のお薦めは、プライマー作成ソフトを利用することなんですが・・・高いんですよね・・。
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この回答へのお礼

色々参考になりました。プライマー作成ソフトは、欲しいですけどちょっとね、給料があまりないもんで・・・。とにかく有難うございます。

お礼日時:2001/01/30 12:01

akiyamaharuka さんの回答に補足します。



akiyamaharuka さんがお書きの本は,秀潤社の「細胞工学」増刊・別冊の中の一つです。その他にも PCR に関する本は何冊かあるみたいです(http://www.shujunsha.co.jp/saizb.html#kikan)。

また,羊土社からは以下の本が出ています。
PCR法の最新技術(http://www.so-net.ne.jp/medipro/yodosha/docs/ser …
PCR実験ノート(http://www.so-net.ne.jp/medipro/yodosha/docs/ser …

秀潤社の方はわかりませんが(e-mail での注文自信は受け付けているようです),羊土社(http://www.so-net.ne.jp/medipro/yodosha/docs/cat …)の方はウェブペ-ジに海外からの注文の仕方が書いてあります。一週間程で届くそうです。
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この回答へのお礼

海外でも注文出来るとは知りませんでした。助かりました。早速見てみようと思うます。有難うございました。

お礼日時:2001/01/30 11:57

僕がデザインした場合ですので、


正しいかどうかは分からないのですが、参考程度にと・・・・

(多分、各々の場合で異なる所が多いと思うので)

僕の場合は、増幅させたい領域の外側に対応した配列を見ながら
以下の条件にあった部分を探していくというやり方でした。

●大体、大きさは20~25塩基
●GC含量が40~60%

勿論、プライマーは増幅させたい領域の『前』と『後ろ』の
二つ用意しなくてはいけませんね。

それぞれ、別の側の鎖からデザインして(探し出して)下さいね。

あと、これは僕もあとから気付いて慌てたのですが、
二つのプライマー(前と後ろの二つね)が
相補しないようにもしなくてはいけないようですね。
大体、許容範囲内の大きさ(相補していても大丈夫な領域の大きさ)は、
この場合4、5塩基以下なようでした。


何かの、参考になれば・・・・・・
(こんなので、なるかなぁー?)  (^^;)ゴメンネ
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この回答へのお礼

参考にさせてもらい色々検討します。有難うございした。

お礼日時:2001/01/30 11:54

ライブラリーからつるのか、プラスミドにクローニングされたものからつるのかで違ってきますが、基本的には以下に紹介する本をおすすめします。



バイオ実験イラストレイテッドシリーズ3
本当にふえるPCR

沢山出回っている本なので簡単に手に入るでしょう。
以前質問されていた原理等も分かると思います。
他にも沢山出てますよ(日本語で)一度本屋をみてみられたら。(PCRをかけるので全くの素人ではないですよね)
ここで気かれるより先ず読んだ方が速いです。全部は説明できませんし。

あと遺伝子解析ソフトでプライマーが目的のの部位意外にアリーニングしないかどうかチェックしておいた方がよいので(気休め程度ですが)それらのソフトもあった方が良いでしょう。
いくつか発売されてます。
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この回答へのお礼

有難うございます。本まで紹介してくださって有難うございます。ただ、その本はなかなか手に入らないと思います。なぜなら、今、私は日本国外に住んでいるのです。取りあえず、手に入れられるようがんばってみます。また、こっちの言葉だとなかなか理解にくるしむところがありこのサイトでお聞きしました。ちなみに、私は、プラスミドにクローニングされたものを使います。
変な日本語ですみません。

お礼日時:2001/01/29 10:39

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