PCRの種類

touch-down PCRとstep-down PCRについて調べているのですが、なかなか見つかりません！！どなたか、ご存知の方がいらっしゃれば教えてください

No.2 ベストアンサー 回答者： 1fan9 回答日時： 2007/10/03 18:52

♯1です。

タッチダウンPCRとステップダウンPCRは同じ意味で用いられていることが多いようです。すみません。

先ほどの回答のtouch-down PCRの例は、一般的に2ステップPCRと呼ばれているようです。

ステップダウンPCR(タッチダウンPCR)では、伸長温度(アニーリング温度)を徐々に下げていき、最終的に目的温度まで下げます。
それは、先ほどの回答に示したとおりですが、その下げ幅は、0.5℃とかのように小刻みにする人もいるようです。

この回答へのお礼

とても、分かりやすい説明をありがとうございました。早速、プログラムを組み実験を行なってみようと思います。

お礼日時：2007/10/04 11:20

No.1 回答者： 1fan9 回答日時： 2007/10/03 13:46

Long PCRとか、Tmの高いプライマーでPCRするときの話でしょうか。

この場合、プライマーのTm値が70度前後の場合が多いと思います。

touch-down PCRではアニーリングの低温のステップを省き、Predenature (94℃）1サイクル後、
↓
Denature　(98℃)
Extention (68℃や72℃)
を25～40サイクル
↓
予備伸長68℃や72℃

というような感じだと思います。

変性denatureと伸長extention(プライマーのTm値が高いのでアニーリングannealingも同時に行える)の2ステップで行います。

step down PCRでは非特異的な断片を極力さけるために、
はじめはExtention温度を高めに徐々に下げていきます。
KOD系のLong PCRの場合、以下の感じのようになります。

プログラムとしては長いです。

Predenature　(94℃)の後、
↓
Denature　(98℃)
Extention (74℃)
を5サイクル
↓
Denature　(98℃)
Extention (72℃)
を5サイクル
↓
Denature　(98℃)
Extention (70℃)
を5サイクル
↓
Denature　(98℃)
Extention (68℃)
を15～25サイクル程度
↓
予備伸長68℃

Long PCRの際のTm値は、最近接塩基対法で求めたものの場合が多いと思います。