卒業研究でPCRを行っています。
しかし、なかなか、思うように増幅できず、悩んでいます。
最近はプライマーダイマーばかり増幅されてしまします。
アニーリング温度やtempreteの量を変更したりと一応工夫はしていますが。。
100サンプルをPCRかけて、ひどいときは全滅という時すらあります。
今ある試薬とプライマーを使って、できる改善方法は何かありますでしょうか!?
それとも、新しいプライマーを設計した方がいいのでしょうか!?
ちなみに、プライマーのTm値 formerd:61.3、reverse:68.1
PCR反応液の組成 TaKaRa Ex Taq 0.25μl、Taq buffer 5μl、dNTPとMgCl2 4μl、temperate 3μlにup to 50μl
A 回答 (4件)
- 最新から表示
- 回答順に表示
No.4
- 回答日時:
hot startも試してみましたか?
ゲノムからだと、F-primerの温度が低いかも??
また、primerの長さはどのくらいでしょう?
知人に恐ろしく長いprimerでTm値も高すぎ?って思われるような物を常に設計している方がいました。それで上手くいってました。
まぁ、そんな人もいるよって程度で聞き流してください。
ただ、hot startは効果あります。
また、サンプルは物によっては凍結融解を繰り返したらダメになるものもあるような??
体を壊さない程度に頑張ってください。
条件を設定してから、サンプル数を増やしたほうがいいですよ。
試薬的にも、労力的にも。
ちなみに私のところは「こういう場合はこのキットを使う」というのがありました。
増やしたい所の情報を持っているのなら、もう一度現在ご使用のキットの説明書きと照らし合わせてみることもお勧めします。
この回答への補足
ご回答ありがとうございます。
primerの長さはF:20bps、R:21bpsです。
長さは特に問題はないと思いますが。。。
ただ、今更ですが、primerはシグマジェネシスから購入していますが、
シグマジェネシスの計算値のTm値と参考書のTm値がかなり異なります。
アリーニング温度について検討する余地がありそうです。
ご指摘いただいた通り、hot start法も試してみます。
No.3
- 回答日時:
プライマーを作り直すのもそうですが、
試薬を変えてみるのもいいと思います。
私は以前、タカラのExTaqを使用していたのですが、
どうもうまく行かなくて他のに変えた経験があります。
CGリッチな領域を増幅しているのであれば、DMSOやbetaine、牛アルブミンを添加すると良い結果が得られることがあります。
100サンプルもPCRをかける前に、きちんとバンドが出る
ことを確認した方が精神衛生上、良いですよ
ご回答いただいたのにお礼が遅くなり、申し訳ありません。
ありがとうございます。
そろそろ新しい試薬を購入しようと考えていたところなので、
他の試薬の購入も検討してみます。
スペーサー領域を増幅させているので、同種内でも変異が大きく、シーケンスしてみないとCGの含有量は分かりません。DMSOやbetaine、牛アルブミンの添加も試してみます。
No.2
- 回答日時:
最初にかからなかったのに、そのうちかかるようになったということから、primer dimerに対して100% muchのprimerなどではないでしょうから、templateが非常に少ないことなどが原因かもしれません。
または、templateを入れる前に、primerと酵素を入れている時間が非常に長い場合、そこで十分なモル数のprimer dimer用のtemplateが形成され、非常に少ないモル数の本来のtemplateがかかりにくくなっている可能性も無いとはいえません。これらの増幅をなくすには合成をし直すのがはやいですが、4年生の学生さんに私がアドバイスするとしたら、primerの濃度を低下させることと、primer mixの調整をし直す。サンプル数を減らして手早くPCRをかけてみて違いを比較するなど、すこし条件も気にかけますね。ドクターの学生にはそうゆうことを言ってる間に合成してやり直せ!ですが、失敗にはいろんなトラブルシューティングをする機会を内包していますので、一度ためしてみても良いかもしれません。実際にprotocol集のなかにはprimer mixやその凍結融解を嫌う物や、primer濃度に気をつかっている物があります。実際に、そのprimerしか設計できないようなPCRに遭遇したときに、対処できるようになるかの良い経験でもありますね。「今ある試薬とプライマーを使って、できる改善方法は何かありますでしょうか!?」についてのお答えとして、こんなところになります。
この回答への補足
ご回答ありがとうございます。
最近はサンプル数を減らしてPCRをかけ、比較検討に力を入れています。
primerやtemplateの量を変えて、いろいろ試してみます。
ただ、12月に入っても結果が出ず、時間的制約がありますが、できる限りはやってみようと思います。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 病院・検査 至急お願いします。コロナについて質問です。 昨日発熱が出て、市販の検査キットで陽性が出ました。 今日 6 2022/11/02 10:08
- 医療・安全 結果論ですが、日本のPCR検査の対応の判断は成功だったと言えるのかな? 5 2022/05/25 06:52
- クーポン・割引券 WEBでユニバのチケットを購入したのいですが、イベント割?のようなもので、『ワクチン接種証明3回分の 1 2022/11/09 15:38
- その他(ネットショッピング・通販・ECサイト) WEBでユニバのチケットを購入したのいですが、イベント割?のようなもので、『ワクチン接種証明3回分の 3 2022/11/09 16:12
- リフォーム・リノベーション ALC外壁のシーリング 6 2022/08/27 21:38
- 病院・検査 この体温計はおかしくないですか? 1 2022/05/23 13:15
- 数学 広島県における新型コロナウイルスの感染率は1万人当たり14人 (2022年12月19日現在) であり 1 2023/01/03 23:43
- 政治 ハイパーインフレにならない程度に円を刷りまくって、貧困層を中心に国民に配りまくったり、 5 2022/09/10 10:31
- その他(暮らし・生活・行事) 安倍にも負けず課税にも負けず悪政にも生活苦にも腐った社会にも腐った連中にも負けず生き抜く 6 2022/07/14 22:36
- 病院・検査 PCR検査について 1 2022/06/24 14:28
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
DNAを室温で放置してしまい、DN...
-
PCRの失敗について
-
RAPDマーカーって何ですか?
-
プライマーダイマーが出てしま...
-
RT-PCRとリアルタイムPCRのプラ...
-
プライマーの劣化凍結融解について
-
PCR組成とDNAのスメア
-
RT-PCRのランダム,オリゴdTプ...
-
定量PCRのスタンダード作製
-
Long PCRのこつ
-
「です・ます体」と「である体...
-
PCRとシークエンス反応
-
mRNA発現量を求める実験法
-
DNAの塩基配列を決定するシーケ...
-
アニーリングの温度設定について
-
PCRでの分子量の見極め
-
PCRがうまくいきません
-
ロングプライマーでのPCR
-
PCRの最初の熱変性と最後の伸長...
-
DNAの吸光度
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
PCRで複数のバンドがでます。
-
PCRとシークエンス反応
-
エキストラバンドがでる理由
-
PCRの失敗について
-
PCRでバンドが2,3本出てしまい...
-
プライマーの劣化凍結融解について
-
PCR組成とDNAのスメア
-
突然PCRがうまくいかなくなりま...
-
プライマーダイマーが出てしま...
-
定量性に欠けると言われるはな...
-
DNAを室温で放置してしまい、DN...
-
定量PCRのスタンダード作製
-
rep-PCRって?
-
DNA断片分析のPCR法で使うMaste...
-
PCR、プライマーとDNA複製について
-
質問です!
-
PCRでの分子量の見極め
-
プラスミドへのインサート長が...
-
転写反応には、どうしてプライ...
-
D-loopについて
おすすめ情報