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ウイルス抗原を検出するためにRT-PCR法を行っています。検出感度を高めるためにNESTED PCRを行っています。
サンプルの調整工程で乳鉢で乳剤を作りますが、コンタミが心配です。
試料調整に使う乳鉢、はさみ、ピンセットなどを利用しますが、これらは使い捨てできません。
DNAのコンタミを防止するために、これらの器具のDNAを完全に破壊したいのですが良い方法はないでしょうか?

初心者で手法について十分に理解しきれていないところがあります。そのほかにコンタミ防止のための良い方法があったら教えていただければ幸いです。

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A 回答 (5件)

>ところで、野外株のシーケンスの一致は95%程度なのでしょうか?


>ポジコンDNAのコンタミを疑う場合に、シーケンスが100%ポジコンに一致した場合に、コンタミであったのではないかとの推測が成り立つのでしょうか?

 それはウイルスによって、また増幅した部位によって違います。
 例えば鶏の伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1蛋白に超可変領域(HVR)と呼ばれる領域があるのですが、この領域は株によって50%などという相同性が当たり前にあったりしますから、この領域である株とある株の相同性が80%もあれば、この2つの株は極めて近いか由来が同じ、と判断したりします。
 反対に牛白血病ウイルス(BLV)や多くのDNAウイルスは極めて保存性が高く、400bpくらい調べても100%一致することが珍しくありませんから、「ここで1塩基違っていた」というのが十分意味を持ったりします。
 ですから、このようなウイルスを調べている時に、ポジコンと100%一致しても、ポジコンのコンタミなのかどうかは容易には判断できません。

 そのあたりのことは、調べたいウイルスの調べたい領域の配列を数十株もGenBankから引っ張ってきてアライメントを取ったフィギュアを1枚作っておけば、サンプルのシークエンスデータが上がってきた時に短時間で判断できます。
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この回答へのお礼

的確な回答ありがとうございました。
GenBankのデータも調べてみたいと思います。
大変参考になりました。

お礼日時:2007/12/16 13:24

 Jagar39です。



 まずコンタミの有無を確認する方法ですが、PCR産物をシークエンスすることは、直接的にその産物が特異産物であることを確認する方法になります。
 プライマーで挟まれた領域の塩基配列は当然既報で判っているでしょうから、シークエンスをして得られた塩基配列がそれと一致すれば、特異産物以外の何物でもないですから。
 もちろん100%一致する必要はありません。変異があるでしょうから。
 どの程度一致すればOKとするのかはウイルスによって異なります。
 でも、95%くらいは一致するのが普通、というウイルスで80%の一致率だった場合、「非特異だったのか?」という疑いもさることながら、「もしかして新種のウイルス?」という可能性もあるわけで、話が面白くなってきてしまうのですが。
 なお、シークエンスデータのホモロジーサーチは、BLASTを使うのが一般的です。
http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html

 しかし、PCR産物の特異性を確認するのにいちいちシークエンスは、普通はしないですね。私が外注に出しているとろこは1検体3,500円なので、特異産物かどうか確認する程度でしたら両側読まなくても片側だけで良いでしょうけど、それでも産物をいちいちシークエンスしていたらたいへんな経費がかかります。
 普通はバンドの位置を確認するだけで十分だと思います。

 リアルタイムPCRは、少なくとも私が今やっている系に関してはNested PCRと同等以上の感度です。Nestedのように産物が入ったチューブを開けて別にチューブに・・なんて作業がない分、キャリーオーバーによるコンタミのリスクは劇的に減らせますし、電気泳動をしなくて良いので泳動槽からのコンタミのリスクはゼロまで減らせます。
 抽出の際のサンプル間コンタミに関するリスクは変わらないので、気を抜くと痛い目に遭うのは変わりませんが、多検体処理はずいぶん楽になりました。

 まあ機械がないとどうにもならないですし、プライマーもほとんどの場合は新たに設計しなくてはならないので、移行は楽ではないですが、診断のような検出した時点で終わるような仕事は、なるべくリアルタイムPCRに移行したいです。
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この回答へのお礼

ご回答ありがとうございました。
お礼が遅れてしまって申し訳ありませんでした。大変参考になりました。
ところで、野外株のシーケンスの一致は95%程度なのでしょうか?
ポジコンDNAのコンタミを疑う場合に、シーケンスが100%ポジコンに一致した場合に、コンタミであったのではないかとの推測が成り立つのでしょうか?

お礼日時:2007/12/14 06:50

 私もまさに同じような仕事をしていますが、ご質問の作業でことさらに「DNAのコンタミ」を心配する必要はあまりないように思われます。


 乳剤を作ってからRNA抽出をするのですが、その抽出がきちんとできていればそこでDNAは除去できてますから。

 むしろ怖いのはDNAではなくウイルスそのもののサンプル間コンタミです。ウイルスが含まれる臓器乳剤を作製し、同じ器具でウイルスが含まれていない臓器を続けて乳剤作製すると、ウイルスが含まれていないはずの臓器でウイルス遺伝子が検出されてしまうリスクが高いですよね。

 それを防止するためには、前の方の回答のとおり、次亜塩素酸が最も手軽かつ確実でしょう。
 「DNAのコンタミ防止」というのであれば、こんなのもありますが・・・
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_in …

 それより大切なのは、「器具一式を数多く用意する」ことです。
 同じ器具をいちいち次亜塩素酸で処理して使い回すと、やはりコンタミのリスクも残りますし何より器具に残った次亜塩素酸で次のサンプルのウイルスが不活化&DNA除去されてしまうのが心配です。
 一度の実験で同じ器具を使い回さずに済むよう、ハサミ、ピンセット、乳鉢等はたくさん揃えておくことが基本です。

 もっと根本的な対策としては、乳鉢ではなくビーズショッカーを使うという手があります。備品を購入しなければならないのでおいそれとはいかないと思いますが、機会があればおねだりすることをお勧めします。
http://www.yasuikikai.co.jp/product/product01.html
 200万くらいする機械ですが・・・
 私はこれを導入してから乳鉢は使わなくなりました。

 RT Nested-PCRは難易度高いです。
 私は非特異はそれほど経験していませんが(あるにはあるけどバンドの位置でほぼ判別可能)、コンタミには本当に悩まされました。
 検査などで毎回異なるウイルス遺伝子を、しかも陽性検体があまり出てこないようなPCRだとたいしてシビアではないのですが、研究などでシークエンス産物を取ろうとかいうような"陽性検体を短期間に数多く処理する"ようなPCRでは、「コンタミとの闘い」になります。
 特にRT Nested-PCRはPCRチューブを開けて作業する工程が増えますので、ほとんど人智ではコンタミ回避は不可能・・・と思えるほどです。

 対策としては、とにかく水やプライマーなど、小分けできるものは全て1回分くらいの量で小分けして使うことです。
 それから電気泳動槽は極めて高濃度に汚染されているので、可能な限りPCRを行うスペースと電気泳動を行うスペースを分けることです。できれば別の部屋にしたいくらいです。
 それと基本ですが、PCRを行うときは必ずネガティブコントロールを立てることですね。私は大事なサンプルをPCRするときは2検体おきくらいにネガコンを挟んでました。もちろんどれか1つにでもバンドが出たら、その検査は非成立、です。
 多検体をPCRしてネガコンにバンドが出てしまったときの経費的なダメージ、そして何より精神的なダメージは計り知れないので、大事なサンプルはあまり多検体処理をしないこと、も教訓ですね。

 リアルタイムPCRをやるようになってから、Mupidなんて見たくもなくなりました。とはいえ、シークエンスするときなどやらざるを得ないこときもあるのですが・・・
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この回答へのお礼

どうもありがとうございました。
コンタミ防止については細心の注意を払うことが必要なんですね。
検体の調整、PCRの調整、電気泳動を別の場所でしてみたいと思います。

リアルタイムPCRを行えば、Nested PCRせずに、同じくらいの感度で、コンタミの危険性も少なく、検体の診断ができるものなのでしょうか?

お礼日時:2007/12/01 03:38

次亜塩素に浸けるが一番簡単かと思います。


適度に薄めた次亜塩に乳鉢、はさみ、ピンセットを半日くらいつけときます。その後DWで洗ってください。
あとは、UVです。
環境が汚染されているなら、部屋全体を希釈した次亜塩素で清掃すると
少しは効果があります。

なんとなく、コンタミではなくて、nestedPCRによる非特異反応の
可能性も考えられますが・・・。
サザンブロッティングしていますか?orシークエンス
昔はnestedPCRが流行っていたので、よく行われていましたが、
nonspe出ますよ。
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この回答へのお礼

ありがとうございました。
次亜塩素処理をして見ます。

泳動像で見る限り写真で見る限り特異バンドではあると思います。
シーケンスを見ることはコンタミを確認するときに良く行う方法なのでしょうか?それでコンタミ有無を確認できるのでしょうか?

お礼日時:2007/12/01 03:22

塩素につけたらどうですか?

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この回答へのお礼

どうもありがとうございました。
やってみたいと思います。
具体的には・・濃度、時間など分かったら教えていただけませんか。

お礼日時:2007/12/01 03:13

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こんにちは。お世話になります。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

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プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

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するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。

一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。

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またダイレクトシークエンスの長所は、クローニングをしないので短期間でシークエンスが可能。短所は読めない配列が多いと聞いたことがあります。
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回答よろしくお願いします。

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こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa(配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね)が5個なので、鋳型はA型が3に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、1:1ではなく、2:1とか4:1の定量性を見るのは難しいかと思います。

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クローニング済みのシーケンスは、1クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
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Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
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プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
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ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
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本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む


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