パルスチェイス・免疫沈降法について

論文を読んでいるのですが、パルスチェイス実験についてわからなくて困っています。酵母内での目的タンパク質（免疫沈降のためＨＡタグ付き）の発現量を見るために、パルスチェイスと免疫沈降を行っているようです。

論文を読んでわかる大まかなプロトコールは以下のようです
(1)細胞をExpre35S35Sで10分パルス（35Ｓメチオニンと35Ｓシステインで標識）
(2)20ｍＭのメチオニンとシステインを含む培地でチェイス
(3)細胞を破砕
(4)anti-HA抗体による免疫沈降
(5)ＳＤＳ-ＰＡＧＥとfluorographyで解析

とあります。

疑問点
・パルスのあとに(2)の操作でメチオニンとシステインを添加するのは何　故でしょうか？チェイスという操作が具体的に何をするのか教えてい　ただきたいです。

・(5)の操作でＳＤＳ-ＰＡＧＥを行うのは理解できるのですが、fluorographyで解析とはどういうことでしょうか？35Ｓを蛍光で見ているということなんですか？

・そもそも目的のタンパクを見るために、35Ｓで標識する必要があるの　ですか？免疫沈降だけでは駄目なのでしょうか？

非常に困っているので、疑問点が一つでも解決して頂ける方はお願いします。

No.1 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2008/06/02 11:47

簡単に

まず、どうして35Ｓメチオニンと35Ｓシステインで標識で標識するのか、考えてみてください。

この作業でタンパク質をラベルするということはどういうことなのか？

何故10分間なのか？
アミノ酸を入れないとタンパク質は出来ません。
（２）の操作を35Ｓメチオニンと35Ｓシステイン入れっぱなしにするとどうなると思いますか？
それで、何故１０分間だと良いのか？

次に、標識するのは、細胞内のすべてのタンパク質です。それを免疫沈降することは何を見たいからなのか？
単純に免疫沈降するということと何が違うのか？

＞35Ｓを蛍光で見ているということなんですか？
ご自分でお書きになっていますが、35Ｓメチオニンと35Ｓシステインで標識しているのです。何故「標識」として機能するのでしょうか？

答えを言うのか簡単ですが、あまりにも異本的なことなので、丸投げに等しいです。
がんばってください。
また何かありましたら、力になれるかもしれません。

この回答への補足

ご回答ありがとうございます。

放射性同位体でタンパク質をラベルし、fluorographyで放射線量を測定するという事まではわかりました。fluorography名前から単純に蛍光が関係していると思い込んでいました。

「（２）の操作を35Ｓメチオニンと35Ｓシステイン入れっぱなしにするとどうなると思いますか？
それで、何故１０分間だと良いのか？」

35Ｓメチオニンと35Ｓシステインを入れっぱなしにせず、10分間だけ取り込ませ、経時的に観察することで代謝の流れを観察できると言う事でしょうか？


「免疫沈降することは何を見たいからなのか？」
　目的としているタンパク質のみの発現量を見るために行っていると解釈しています。

「単純に免疫沈降するということと何が違うのか？」
　まず最初に「免疫沈降して得た目的のタンパクをＳＤＳ-ＰＡＧＥに流し、ゲル中の放射標識タンパク質をフルオログラフィーで検出する事で正確に定量を行うことができる。」という考えが浮かびましたが、それが答えではないと思いました。
　この場合もやはり、標識と免疫沈降を組み合わせる事によって代謝経路を見れるという事なのでしょうか？単純に免疫沈降を行う場合では、目的のタンパク質が、どれだけの時間存在しているのかが見られないと考えました。

何回も申し訳ないのですが、間違っている箇所があればご指摘頂けると非常に助かります。よろしくお願いします。
　

補足日時：2008/06/02 23:27

No.2 回答者： otx 回答日時： 2008/06/03 02:33

その論文の実験の目的によって異なりますが・・・

例えばです。

あるタンパク質はある時点で合成されてからものすごく安定で、１０時間以上存在するとします。
そのタンパク質の細胞内での動き、たとえば合成されてどのように細胞内を動いて（小胞体からゴルジ体、そしてトランスゴルジネットワークなどなどへ）いくのか？

その動きを解析したい場合、何もしないと１０時間安定なタンパク質の、どれができたてタンパク質でどれが１０時間経ったタンパク質か見分けつきますかね？

ある時点で合成されるタンパク質をラベルして、経時的に細胞をサンプリングしてそのタンパク質の動きを、たとえば細胞を遠心したりして分画したサンプルを解析するとわかると思いませんか？

はじめの回答にも書きましたが、ラベルされるタンパク質はその時合成された細胞内のタンパク質「すべて」です。

わかりますか？細胞は生きているわけですから、目的のタンパク質以外にもたーーーくさんのタンパク質を合成しているわけですよ。
ただ泳動しただけでは、標識されたタンパク質のバンドがたーくさん出ると思います。
そんな中から、分子量だけでは目的のたんぱく質は見分けはつかないと思いませんか？

なので、標識されたたーーくさんのタンパク質の中から、自分が見たいタンパク質だけを集める作業が必要だと思いませんか？

実際、どのような論文かわかりませんので、一般的に考えられることを簡単に書きました。
やっている作業とその特色を考えれば、何が目的であるかよく考えればわかると思います。

この回答へのお礼

再びのご回答ありがとうございました。

論文では目的タンパク質の糖鎖修飾を経時的に追っていくというものでした。ご指摘のおかげで、解らなかった問題点が解決できました。心よりお礼申し上げます。

お礼日時：2008/06/03 10:30