大腸菌でタンパクを発現させ、超音波破砕をし、遠心して上清を回収することで、目的のタンパク質を回収する方法があります。目的のタンパクは、GSTなどの可溶性の高いタンパクを結合させることによりペリプラズム間に移行させます。
 ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね?
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム&菌体内全部における可溶性の高いタンパクの回収したことになるのでしょうか?
 また、上記の遠心後のペレットの方も上清画分と同様に、SDS-PAGEを行いました。ペレットにはかなり様々なバンドが濃く見えました。
(4)SDS-PAGEをすると菌体は全体が壊れると思いますが、これはSDS-PAGEにおいて泳動する前に、サンプルにSDSを入れてboilする過程において菌体が破裂するのですよね?
(5)界面活性剤(SDS)を加えただけでは、菌体は破壊できませんよね?(6)界面活性剤でペリプラズムのみ壊せているのでしょうか?
 長くなりすみません。菌体が全部壊れているのか、ペリプラズムだけ壊れているのかよく分からなくなってしまったのです。
(7)最後に、凍結粉砕という方法もありますが、こちらも菌体全部壊れますよね?
大変こんがらがってしまいました。どなたか、よろしくお願いします。

A 回答 (2件)

(1)そうだと思います。

何でもかんでも壊していることになると思います。

(2)大腸菌を浸透圧ショックで壊す方法を、私は今まで見たことがありません。っていうか、真水でも浸透圧で壊れないのでは?

(3)そうだと思います。そもそも、(1)でもそうですが、超音波では、大腸菌の何をどこまで壊すという微妙な操作は難しすぎると思います。

(4)いいえ。そもそも室温のSDS溶液でも溶けます(低温すぎて析出している場合はだめな気がしますが)。ボイルは完全に溶かす念のためです。

(5)いいえ。壊れます。

(6)いいえ。おそらく全部壊れていると思います。
大腸菌からプラスミドを抽出したことはありますか?それならばわかると思いますが、
プラスミドを抽出するときに大腸菌を壊す作業があるのですが、
用いる溶液にはSDSが入っています。
このとき、ボイルしなくても溶けてしまいます。
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この回答へのお礼

お礼が遅くなりすみません。ご丁寧にありがとうございました。大変参考になりました。

お礼日時:2009/05/26 22:02

あ、(7)目的は菌体全部壊すためだと思いますが、効率が良い方法ではないと思いますので、完全に壊れないとは思います。


この方法では、大腸菌のある部分だけを壊すという操作は出来ないと思います。
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この回答へのお礼

お礼が遅くなりすみません。参考になりました。ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/26 22:01

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超音波で骨密度が測定できるそうですが、扱っている会社名と大体の金額が知りたいのですが?

Aベストアンサー

●超音波式骨密度測定装置:CM-100

古野電気株式会社(開発・製造)←魚群探知機で有名
〒662-8580 西宮市芦原町9-52
TEL0798-63-1100 FAX0798-63-0794
エルクコーポレーション(販売)
Tel.06-6942-0691

値段はあってないようなものであるのがこの業界の常識です(笑)個別にお問い合わせください。

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(研究テーマが研究室のメインとはややズレており、なかなか研究費が降りないため、できうる限り低コストな策があればありがたいです)

また、目的タンパクの性質(pKa、親水性?疎水性?、立体構造など)を調べる方法やソフトがあれば教えて下さい.
ちなみに、Protein Data Bankで調べてみましたが、残念ながら登録されていないようでした.

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現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているよ...続きを読む

Aベストアンサー

>10L cultureで200 ug程度

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>どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

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http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000420&subcatcd=B1000430&unitid=U100003709

http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/protein_preparation/lysis.asp

http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/Protein/cellytic/first.htm

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Q大腿骨頸部骨折について

先日66歳の母が大腿骨頸部骨折で入院しました。

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母は鬱病を煩っているため、この先の再手術を考えてしまい、さらに症状が悪くなります。

壊死を防ぐ事や骨がつく為に良いことなどは何かありますか?(医者にはないと言われましたが・・・。)
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No.1です。すいません読み間違いをしていました。


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お大事に。

QPAGEとSDS-PAGEの違いについて

PAGEの一種がSDS-PAGEであることは分かるのですが、
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PAGEとSDS-PAGEの違いがよく分からないので、教えてくださいませんか?大学一年生によく分かるように教えてくれませんか?

Aベストアンサー

 私、今その実験をしているものですが、界面活性剤としてSDSを使うのが、SDS-PAGE、それを使わないのが普通のPAGEです。
 SDS-PAGEは主にタンパク質の分子量を測るわけですが、タンパク質自体に電荷があり、分子量が大きいものほど電荷が大きいのです。その電荷の違いを中和するために、ゲルの方にSDSを入れます。
 一方、タンパク質側にも入れますが、これは、タンパク質を変性させます。
 詳しくは、参考URLのWikipediaでどうぞ。

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE

Q超音波美顔機の良し悪し

この前初めて超音波美顔機を使ってみたら、その即効性のある効果(小顔)にびっくりして 自分でも欲しくなりました。 欲しいといっても30万くらいするのは無理なので3~5万くらいの枠で・・・。

それであれこれ調べていたら、超音波美顔機を使うと余計たるむと聞きました。 それって恐いですよねぇ・・・。きっと2~3日おきにちゃんと使っていれば問題ないのだと思いますが、実際美顔機使ってらっしゃる方どう思います?

後、これはプロのエステシャンに聞いた話ですが、超音波って実は恐いと言ってました。
しかも、もともと顔に使ってはいけないって。 
というのは、初めて日本で超音波を発明した人がいて、それを真似て他のメーカーなどが作るのは、周波数が正しくなくて、骨に悪影響があるとか・・・。 ちなみに安いのも、30万くらいするやつも同じだって・・・。

私は顔が太りやすいので、超音波美顔機を使ってみて、これは!と感動したのですが、 そういわれるとなんか恐くて買えません。

なにかご存知の方、ご意見お聞かせください。

Aベストアンサー

google で 「教えて美顔器」 と入れると、美顔器の

高周波が体に与える影響についての質問に答えいる掲

示板がありましたよ!!

ちなみに私は、大手電気メーカの美顔器を一年程使って

いますが、良い感じですよ。

あまり参考にならないかもしれませんが…

QNative-PAGE SDS-PAGE 分子マーカー 電気泳動

Native-PAGEに用いる分子マーカーを探しています。

Native-PAGEを行ったときに、SDS-PAGEに用いる分子マーカーを使用したところ泳動速度が違ったせいかsampleの進み方が遅かったようです。

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Native-PAGEでこの大きさのタンパクを見る場合、適した分子マーカーがありましたら、教えていただけないでしょうか?

よろしくお願いします

Aベストアンサー

大前提として、Native PAGEにおけるタンパク質の移動度は分子量以外に電荷や形状に大きく左右されます。つまり、移動度=分子量とは一概には言えないということを頭に入れておいてください。また、Native PAGEにも様々な実験系があります。おそらく用いているのはDavisの系(SDS-PAGEのSDS抜き)だと思いますが、場合によっては他の方法(Hedrick&Smith法など)を用いる必要もあるかと思います。

Davisの系ですと、まず、GEヘルスケアでNative PAGE用のマーカーが売られていますが、目的とされるタンパク質のレンジにはマーカーがありません。調べてみたところ、Couch et al. (2004) J Bacteriol. 186 : 35-42. にchymotrypsinogen A (25 kDa)とalbumin (67 kDa)を使っていると記述されていますので、試してみてはいかがでしょうか?


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