大腸菌でタンパクを発現させ、超音波破砕をし、遠心して上清を回収することで、目的のタンパク質を回収する方法があります。目的のタンパクは、GSTなどの可溶性の高いタンパクを結合させることによりペリプラズム間に移行させます。
 ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね?
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね?
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム&菌体内全部における可溶性の高いタンパクの回収したことになるのでしょうか?
 また、上記の遠心後のペレットの方も上清画分と同様に、SDS-PAGEを行いました。ペレットにはかなり様々なバンドが濃く見えました。
(4)SDS-PAGEをすると菌体は全体が壊れると思いますが、これはSDS-PAGEにおいて泳動する前に、サンプルにSDSを入れてboilする過程において菌体が破裂するのですよね?
(5)界面活性剤(SDS)を加えただけでは、菌体は破壊できませんよね?(6)界面活性剤でペリプラズムのみ壊せているのでしょうか?
 長くなりすみません。菌体が全部壊れているのか、ペリプラズムだけ壊れているのかよく分からなくなってしまったのです。
(7)最後に、凍結粉砕という方法もありますが、こちらも菌体全部壊れますよね?
大変こんがらがってしまいました。どなたか、よろしくお願いします。

A 回答 (2件)

(1)そうだと思います。

何でもかんでも壊していることになると思います。

(2)大腸菌を浸透圧ショックで壊す方法を、私は今まで見たことがありません。っていうか、真水でも浸透圧で壊れないのでは?

(3)そうだと思います。そもそも、(1)でもそうですが、超音波では、大腸菌の何をどこまで壊すという微妙な操作は難しすぎると思います。

(4)いいえ。そもそも室温のSDS溶液でも溶けます(低温すぎて析出している場合はだめな気がしますが)。ボイルは完全に溶かす念のためです。

(5)いいえ。壊れます。

(6)いいえ。おそらく全部壊れていると思います。
大腸菌からプラスミドを抽出したことはありますか?それならばわかると思いますが、
プラスミドを抽出するときに大腸菌を壊す作業があるのですが、
用いる溶液にはSDSが入っています。
このとき、ボイルしなくても溶けてしまいます。
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この回答へのお礼

お礼が遅くなりすみません。ご丁寧にありがとうございました。大変参考になりました。

お礼日時:2009/05/26 22:02

あ、(7)目的は菌体全部壊すためだと思いますが、効率が良い方法ではないと思いますので、完全に壊れないとは思います。


この方法では、大腸菌のある部分だけを壊すという操作は出来ないと思います。
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この回答へのお礼

お礼が遅くなりすみません。参考になりました。ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/26 22:01

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まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

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1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
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酵素溶液の保存方法について教えてください。

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2.酵素の種類によっては、グリセロールで失活することもあるのでしょうか?

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Aベストアンサー

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使用期間ですが、実験の精度や酵素の性質によるので何ともいえません。10mlも作って分注して試されたらよろしいかと思います。


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