出産前後の痔にはご注意!

HPLCを用い液体の分析をしたいです。HPLC用アセトニトリル(CH3CN)を溶媒として用い、液体の分析を行った。取りあえず、蒸留水で測定したところ3.60min付近ピークが表示しました。アセトニトリルだけを測定したところ3.60min付近ピークが表示されました。何も、入れない状況した測定したところ同様に3.61min付近のピークが表示されました。これはどうしてですか?

A 回答 (4件)

 インジェクションの構造とか、検出器の種類が判らないので確実なことはいえませんが、空気ということはないですか?カラムの容積を溶出液の流速で割った値が3.6分くらいだとしたら可能性大だと思います。


 あるいはグラジエントを掛けているとしたら異種の溶媒が混合した際に気泡が生じているとか。
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この回答へのお礼

返信が遅くになってすみません!アドバイス、ありがとうございました!

お礼日時:2009/09/02 11:23

こんにちは。



どのようなサンプルを測定しても、どんなピークよりも早いリテンションタイムで出てくるピークは、インジェクションに基づくショックピークです。インジェクションの際には流路を切り替えますが、このときに僅かですが溶液の濃度、組成が急激に変化します。その影響が見かけ上のピークとして表れるのです。

言いかえれば、このショックピークこそが実際にインジェクタからカラムを通じてディテクタを通過したポイントなのです。

ショックピークは空気ではありませんし、インジェクションバルブの交換の必要もありません。自称専門家の誤った発言に惑わされないようにするにも、こうしたサイトでは重要なことですね。
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この回答へのお礼

こんにちは!
返信が遅くになってすみません!色々教えてもらってありがとうございました!

お礼日時:2009/09/02 11:20

>何も、入れない状況した測定した


これが「インジェクションバルブを操作しただけ」という意味なら、#1のお答え通りインジェクションバルブの不良により、空気や残留溶媒などが注入されている可能性大です。
インジェクションバルブを交換してみてください。
自動型の物だと結構やっかいですが、手動型の物に一時的に交換して試してみて下さい。
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この回答へのお礼

よいアドバイスになりました。ありがとうございました!これからも色々と教えてもらいますか?

お礼日時:2009/09/02 11:21

測定波長における移動相とサンプルの溶媒の吸光度の違いによる、


単なるソルベントピークでしょう
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この回答へのお礼

困っている時、お手伝ってありがとうございました!

お礼日時:2009/09/02 11:24

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QHPLCについて質問です

最近HPLCを使い始めたもので、勉強不足で申し訳ありません。
逆相のカラム(ODS)を用いて分離を行っているのですが、ターゲットとしている物質(疎水性が高い)のほかにピークが出ています。このピークは、1分半くらいに見られほとんど分離できていないようです。溶離液を水:アセトニトリル=1:1まで変えて極性をあげてみたのですが、このピークの保持時間はほとんど変化が見られませんでした。カラムはほかにシリカにオクチル基を結合したものしか所有しておりません。この早い保持時間にみられる物質を分離するいい方法はありませんか?溶離液の極性を上げすぎた場合、ターゲットの物質のほうが溶けきれなくなってカラムを駄目にすることなどあるのでしょうか?
また、分離の原理のところで疎水性相互作用で分離すると書いてある物と極性の差によって分離すると書いてあるものがあるのですが、極性が高い=親水性と理解してよろしいのでしょうか?
ながながとすみません。どうかよろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

ODSカラムは何本使ったか、もう記憶にありませんが、結構タフであったと思います。一度でだめになったことが一回だけありました。新品のカラムを溶離液に置換するとき流量をいきなり早め、ベースラインが安定せず、あきらめたことがありました。

一度、基本の説明をお読みすることをお勧めします。

カラムがだめになると、正常の一本のピークが分裂する現象や(これはもうだめ)、圧力が徐々に上昇していくので解ると思います(圧力あがってきたときは、よく80%のMeOHで洗浄していました。このとき、いっぱい詰まっていたのが出てきます)。

色々試すことで、LCは得意になっていきますよ。

QHPLCについて

有機化合物をHPLCを用いて定性・定量しております。
検出器はUV、移動層は50%メタノール溶液です。

質問があります。空気や溶媒のピークというものは出てしまうものなのでしょうか?(保持時間が一番短いピークは空気や溶媒のピークなのでしょうか)
それとサンプル注入量をどのくらいにしたら精度や感度が上がるのでしょうか?

どなたかご存知の方いらっしゃいましたら意見をお願い致します。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

こんにちは。HPLC分析は追っていくと奥が非常に深く、難しいものです。簡単なところから解説しましょう。まず、
1)空気のピーク:これは通常溶存酸素と呼ばれ、分析においてはもろに影響します.ですから、様々なメーカーの機器でもデガッサーと呼ばれる除去装置が付いていますが、基本的には移動相は脱気して使用します。それでも、やはり感度を上げ、ノイズ拡大しますとわかります。特に水がリッチの場合は十分な脱気が必要です。しかし、飛び易い有機溶媒が入っている場合は、ただ長時間脱気しますと移動相の組成そのものに変化をきたしますので注意が必要です。この溶存酸素問題の解決には各メーカーでの大きな改良ポイントとなっているのは事実です。
2)溶媒のピーク:これは溶媒によって異なりますが、例えば極微量ながらもNaOH水溶液なんかが入っていると最初の方にいびつで鋭利なピークが検出されますが、分析したいピークに重ならなければ、溶媒由来のピークとして処理出来ますので、問題はありません。
3)保持時間が短いピーク!?:これは、おそらくインジェクションノイズと呼ばれ、ニードルがサンプル溶液を吸った際に発生する機器由来の初期制動を示すものです。ただ、これは分析時間サンプル吸引速度にも由来しますが、おおよそ2~3分付近に現れます。形としては特徴があり、ほぼ一旦鋭利なピーク後ベースラインより下がって、再びベースラインに戻る感じです。
4)サンプル注入量等:これはやってみなくてはわかりませんが、5,10,20uLが主流ですが、機器によっては100uLと多いのが主流の機器もあります。当然、同じ感度で見た場合、注入が多いとピークも大きくなります。注入量に関してはまず、機器に最もオーソドックスな値で行い、大事なのはサンプル吸引速度で溶媒に粘度がある場合は、吸引速度をゆっくり設定しないとちゃんと吸えずに、場合によってはエアーを噛んでしまう場合も…。通常ですと、例えば注入量を10uLとした場合、吸引速度は10~20uL/minで1分以内にインジェクションが終了するように設定しますが、こればかりは何度か設定してみないとわかりません。
5)感度設定:これは設定可能な機器とそうでない機器があり、AUまたはmAU…etc.色々と記載しましたが、確実に使用する種類の機器メーカーがわかればもっと詳細な回答が出来るかと思います。では、頑張ってみて下さい。

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QHPLCの溶媒ピーク

HPLCの溶媒ピークについて質問です。現在、あるサンプルをUV検出器を利用してHPLC分析おこなってます。移動層はアセトニトリルと水&0.1%リン酸のグラジエントです。サンプルはメタノールに溶解して10μLでインジェクトしてます。標準曲線のR2も0.95以上の値がでてます。
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ご教授お願い致します。

Aベストアンサー

アセトニトリルに溶けない,メタノールに溶ける.
ってことは,ふつうに考えれば極性が非常に強いってことです.
現状,どのくらいのカラムでどのくらいのリテンションタイムなのかがわからないのでなんとも言えませんが,非常に初期に,というか,保持されずにスルーで出てきてるんじゃないですかね.
そういうのは,HPLC の分析条件としては普通はアウトなんですが,まあ,試料中の共存物は保持され,ターゲットは保持されないという条件でも,見かけ上は測定できますが,保持されない共存物はみんなかぶってしまうので,ふつうならそんな条件で出された分析結果は誰もまじめに取り合いません.
溶離液の極性をもっと落とす,それでは溶けないというならそもそも逆相分析自体が無理というか.
あるいは弱酸系ならリン酸の添加プログラムとかで調整できるかもしれませんが.
これ以上は実データを見ないとアドバイスのしようもありません.
少なくとも,これまでの内容からは分析条件から再検討するべきだと思います.

QHPLCの負のピーク

HPLC初心者です。
HPLC分析結果に、どの物質を分析しても必ず1分台に負のピークが出てしまうのですが、
これはなぜなのでしょうか。
また、負のピークは本来なら出てはいけないものなのですか?
わからないことばかりですみません。
どなたかお願い致します。

Aベストアンサー

私の経験から先に結論を言いますと、負のピークがでても測定に問題ありません。
  但し、インジェクション部、カラムの接続部等に問題がないことが前提です。
  もう一度各部を点検してください。

QまたまたHPLCで教えてくださいな!

えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。

Aベストアンサー

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も...続きを読む

Q統計学でいうRSD%とは何ですか。

統計学でいうRSD%の平易な説明と計算方法を知りたいのですが。標準偏差はわかります。

Aベストアンサー

RSD%とは、相対標準偏差をパーセントで表示したものと思われます。

相対標準偏差(%)=(標準偏差/平均値)×100

次のページは、「相対標準偏差 RSD 平均値」で検索して出たものの一つです。
http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

参考URL:http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

QHPLCの負のピーク

HPLCで目的物の正のピークの後に、
ピークがベースライン付近に戻ったところから、
負のややブロードなピークが必ず出てきます。
どなたか原因と対策をご存じないですか?

カラム:SHODEX SP0810(糖分析用カラム)
カラム温度:80度
移動相:水
サンプル:しょ糖水溶液

Aベストアンサー

ショ糖水溶液の由来というか、他にどのような物が含まれているかによるかもしれません。
サンプルにナトリウムやカルシウムなどの陽イオンが含まれていると、カラムから鉛イオンが外れてメインピークの後ろに谷ができる可能性があります。
カラム温度が高いこともちょっと気になります。50~60℃くらいにしてみてはどうでしょうか。熱やpHで糖の変成が起きることもありますから、カラムの中で何かが起きたら嫌ですもの。

Showdexのサイトで次のようなドキュメントを見つけました。
http://www.shodex.com/japanese/dc030404.html
カラムは低流速で長時間かければ再生できますから、サンプルにNaClを少し入れて量を変えて、試してみたらいいかもしれません。
溶離液に鉛イオンを導入するのは最後の手段でしょうね。

Q液クロの水由来のゴーストピークについて

HPLCグレードの水を用いているにもかかわらず、
下のような条件で分析すると、50mAU以上の強度で水由来のゴーストピークが必ず出ます。

HPLCグレードの水でもしかたのない問題なのでしょうか? それとも品質に問題があるロットだったのでしょうか?

HPLC初心者なので、どのように判断し対処したらよいのか分かりませんので、教えて頂けたら大変助かります。


【分析条件】
水-アセトニトリルのグラジエント
検出器:UV220nm または 260nm

Aベストアンサー

これは、グラジエント分析時によくある現象ですね。

溶出力の弱い組成になっている時間に溶離液中の不純物がカラムに濃縮されます。グラジエント操作により、溶出力が強まったところで、濃縮された不純物が一気に溶出されることで、大きなゴーストピークが出現してきます。

HPLCグレードでも十分な純度を持っているとは限らないようです。

手間はかかりますが、水を分析カラムに通してから溶離液調製すると、問題不純物が吸着されてしまうので、改善されるはずです。

あっ、別のカラムで吸着するか、本番の分析前に吸着に使用したカラムを洗浄するか、どちらかの対処をお忘れなく~。

QHPLCカラムの洗浄方法

逆相のカラムは使用後に必ず水で洗浄した上で、適当な水:溶媒系に置換するものだと思っていたのですが、今私が勤務しているところでは、誰も水で洗いません。ていうか、50%アセトニトリルを流すことを「洗浄」と称しています。実際、これでいいんですかね?

Aベストアンサー

#6です。お恥ずかしい限りです。
おっしゃる通り、「水:メタノール=9:1」の間違いです。別の分析条件でよく使っていたのでついつい・・・。

それから、#7さんの回答でもうひとつ思い出しました。どのようなバッファーだったかは忘れましたが、移動相をメンブランフィルターに通してからでないと使えないものがありました。

brassardさんの直面している条件で有効かどうかわかりませんが、予防の意味で一度試してみては?

既に同様の処置を済ませた上でのご質問でしたらご容赦下さい。

Q統計学的に信頼できるサンプル数って?

統計の「と」の字も理解していない者ですが、
よく「統計学的に信頼できるサンプル数」っていいますよね。

あれって「この統計を調べたいときはこれぐらいのサンプル数があれば信頼できる」という決まりがあるものなのでしょうか?
また、その標本数はどのように算定され、どのような評価基準をもって客観的に信頼できると判断できるのでしょうか?
たとえば、99人の専門家が信頼できると言い、1人がまだこの数では信頼できないと言った場合は信頼できるサンプル数と言えるのでしょうか?

わかりやすく教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

> この統計を調べたいときはこれぐらいのサンプル数があれば信頼できる・・・
 調べたいどの集団でも、ある一定数以上なら信頼できるというような決まりはありません。
 何かサンプルを集め、それをなんかの傾向があるかどうかという仮説を検証するために統計学的検定を行って、仮設が否定されるかされないかを調べる中で、どの検定方法を使うかで、最低限必要なサンプル数というのはあります。また、集めたサンプルを何か基準とすべき別のサンプルと比べる検定して、基準のサンプルと統計上差を出すに必要なサンプル数は、比べる検定手法により計算できるものもあります。
 最低限必要なサンプル数ということでは、例えば、ある集団から、ある条件で抽出したサンプルと、条件付けをしないで抽出したサンプル(比べるための基準となるサンプル)を比較するときに、そのサンプルの分布が正規分布(正規分布解説:身長を5cmきざみでグループ分けし、低いグループから順に並べたときに、日本人男子の身長なら170cm前後のグループの人数が最も多く、それよりも高い人のグループと低い人のグループの人数は、170cmのグループから離れるほど人数が減ってくるような集団の分布様式)でない分布形態で、しかし分布の形は双方とも同じような場合「Wilcoxon符号順位検定」という検定手法で検定することができますが、この検定手法は、サンプルデータに同じ値を含まずに最低6つのサンプル数が必要になります。それ以下では、いくらデータに差があるように見えても検定で差を検出できません。
 また、統計上差を出すのに必要なサンプル数の例では、A国とB国のそれぞれの成人男子の身長サンプルがともに正規分布、または正規分布と仮定した場合に「t検定」という検定手法で検定することができますが、このときにはその分布を差がないのにあると間違える確率と、差があるのにないと間違える確率の許容値を自分で決めた上で、そのサンプルの分布の値のばらつき具合から、計算して求めることができます。ただし、その計算は、現実に集めたそれぞれのサンプル間で生じた平均値の差や分布のばらつき具合(分散値)、どのくらいの程度で判定を間違える可能性がどこまで許されるかなどの条件から、サンプル間で差があると認められるために必要なサンプル数ですから、まったく同じデータを集めた場合でない限り、計算上算出された(差を出すために)必要なサンプル数だけサンプルデータを集めれば、差があると判定されます(すなわち、サンプルを無制限に集めることができれば、だいたい差が出るという判定となる)。よって、集めるサンプルの種類により、計算上出された(差を出すために)必要なサンプル数が現実的に妥当なものか、そうでないのかを、最終的には人間が判断することになります。

 具体的に例示してみましょう。
 ある集団からランダムに集めたデータが15,12,18,12,22,13,21,12,17,15,19、もう一方のデータが22,21,25,24,24,18,18,26,21,27,25としましょう。一見すると後者のほうが値が大きく、前者と差があるように見えます。そこで、差を検定するために、t検定を行います。結果として計算上差があり、前者と後者は計算上差がないのにあると間違えて判断する可能性の許容値(有意確率)何%の確率で差があるといえます。常識的に考えても、これだけのサンプル数で差があると計算されたのだから、差があると判断しても差し支えないだろうと判断できます。
 ちなみにこの場合の差が出るための必要サンプル数は、有意確率5%、検出力0.8とした場合に5.7299、つまりそれぞれの集団で6つ以上サンプルを集めれば、差を出せるのです。一方、サンプルが、15,12,18,12,21,20,21,25,24,19の集団と、22,21125,24,24,15,12,18,12,22の集団ではどうでしょう。有意確率5%で差があるとはいえない結果になります。この場合に、このサンプルの分布様式で拾い出して差を出すために必要なサンプル数は551.33となり、552個もサンプルを抽出しないと差が出ないことになります。この計算上の必要サンプル数がこのくらい調査しないといけないものならば、必要サンプル数以上のサンプルを集めて調べなければなりませんし、これだけの数を集める必要がない、もしくは集めることが困難な場合は差があるとはいえないという判断をすることになるかと思います。

 一方、支持率調査や視聴率調査などの場合、比べるべき基準の対象がありません。その場合は、サンプル数が少ないレベルで予備調査を行い、さらにもう少しサンプル数を増やして予備調査を行いを何回か繰り返し、それぞれの調査でサンプルの分布形やその他検討するべき指数を計算し、これ以上集計をとってもデータのばらつきや変化が許容範囲(小数点何桁レベルの誤差)に納まるようなサンプル数を算出していると考えます。テレビ視聴率調査は関東では300件のサンプル数程度と聞いていますが、調査会社ではサンプルのとり方がなるべく関東在住の家庭構成と年齢層、性別などの割合が同じになるように、また、サンプルをとる地域の人口分布が同じ割合になるようにサンプル抽出条件を整えた上で、ランダムに抽出しているため、数千万人いる関東の本当の視聴率を割合反映して出しているそうです。これはすでに必要サンプル数の割り出し方がノウハウとして知られていますが、未知の調査項目では必要サンプル数を導き出すためには試行錯誤で適切と判断できる数をひたすら調査するしかないかと思います。

> どのような評価基準をもって客観的に信頼できると判断・・・
 例えば、工場で作られるネジの直径などは、まったくばらつきなくぴったり想定した直径のネジを作ることはきわめて困難です。多少の大きさのばらつきが生じてしまいます。1mm違っても規格外品となります。工場では企画外品をなるべく出さないように、統計を取って、ネジの直径のばらつき具合を調べ、製造工程をチェックして、不良品の出る確率を下げようとします。しかし、製品をすべて調べるわけにはいきません。そこで、調べるのに最低限必要なサンプル数を調査と計算を重ねてチェックしていきます。
 一方、農場で生産されたネギの直径は、1mmくらいの差ならほぼ同じロットとして扱われます。また、農産物は年や品種の違いにより生育に差が出やすく、そもそも規格はネジに比べて相当ばらつき具合の許容範囲が広くなっています。ネジに対してネギのような検査を行っていたのでは信頼性が損なわれます。
 そもそも、統計学的検定は客観的判断基準の一指針ではあっても絶対的な評価になりません。あくまでも最終的に判断するのは人間であって、それも、サンプルの質や検証する精度によって、必要サンプルは変わるのです。

 あと、お礼の欄にあった専門家:統計学者とありましたが、統計学者が指摘できるのはあくまでもそのサンプルに対して適切な検定を使って正しい計算を行ったかだけで、たとえ適切な検定手法で導き出された結果であっても、それが妥当か否か判断することは難しいと思います。そのサンプルが、何を示し、何を解き明かし、何に利用されるかで信頼度は変化するからです。
 ただ、経験則上指標的なものはあります。正規分布を示すサンプルなら、20~30のサンプル数があれば検定上差し支えない(それ以下でも問題ない場合もある)とか、正規分布でないサンプルは最低6~8のサンプル数が必要とか、厳密さを要求される調査であれば50くらいのサンプル数が必要であろうとかです。でも、あくまでも指標です。

> この統計を調べたいときはこれぐらいのサンプル数があれば信頼できる・・・
 調べたいどの集団でも、ある一定数以上なら信頼できるというような決まりはありません。
 何かサンプルを集め、それをなんかの傾向があるかどうかという仮説を検証するために統計学的検定を行って、仮設が否定されるかされないかを調べる中で、どの検定方法を使うかで、最低限必要なサンプル数というのはあります。また、集めたサンプルを何か基準とすべき別のサンプルと比べる検定して、基準のサンプルと統計上差を出すに必要な...続きを読む


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