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No.1
- 回答日時:
同様の仕事をしています。
まず間違いなくコンタミでしょう。
陰性検体ならまだしも、陰性コントロールで増幅が起きるということは、陰性コントロールのwellに増幅され得るテンプレートが混入したことを意味します。
それが陽性検体からのDNAなのか、関係ない非特異DNAなのかはCYBR-Green法でやっておられるのでしたら解離曲線を見れば判ります。
まあいずれにしろ、陰性コントロール検体で増幅が見られた時点で、その検査全体が成立せず棄却しなければなりませんけど。
何が汚染したか、は判りません。ざっと考えられるだけでもピペット、PCRキットの試薬、プライマーやプローブ、量の調整に使う水あたりでしょうか。
ピペットが汚染したことによる1回限りのコンタミなら良いのですが、プライマーや試薬がコンタミしていると少々やっかいです。(でもピペットが汚染されるとたいてい試薬か何かが汚染される)
調べる方法は、試薬、プライマー、プローブ、水など汚染が疑われるモノを1つずつ替えながらPCRをしていく以外にありません。面倒ですが仕方ないですね。
リアルタイムPCRは電気泳動がないのでコンベンショナルなPCRより格段にコンタミのリスクは少ないです。電気泳動槽中のバッファって、もの凄く濃厚なコンタミ源ですから。
ですからリアルタイムPCRでコンタミを起こしたということは、多くの場合は技術的に未熟であることに原因があることが多くいです。
コンタミ源の調査と同時に、ご自分の作業をもう一度念入りに点検することをお勧めします。
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