出産前後の痔にはご注意!

先日大腸菌・酵母から抽出したDNAを電気泳動にかける実験を行ったのですが、どうも理論値とそれぞれ300bp・80bpほどずれた値が出てしまいました。

なぜこのような差が出てしまったのか、分かる方、教えてください。

ちなみに実験手順はDNAの抽出→PCRによる増幅→電気泳動です。

A 回答 (4件)

アガロースの濃度にもよりますが、その程度なら誤差範囲だと思いますよ。

2100と1800、820と740を完全に判別できる系でやってたりしますか?

PCR産物の量や、PCRからのバッファの持ち込みなんかで、バンドの位置は平気で前後します。自分もジェノタイピングのPCRで、目的800強が1000bpを超えた位置に出たこともありましたし、下手な人の泳動像なんかだと、同じもののはずなのに、バンドの位置がデコボコしてたり。ポジコンがあるなら、そのバンドの位置と比較ができますね。

産物を別の目的に利用するなら、配列を読むなり、適当な制限酵素で切るなりして、産物が目的のものか確認したらよいと思います。
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ああ、最後読んでませんでした。

PCR増幅したんですね。

としても、産物長が分からないことには、何とも言えないです。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます!

産物長はそれぞれ2100bp820bpでした。


どちらも理論値より短い結果となりました。

PCRによる増幅の際にポリメラーゼの失活などにより理論値とずれることはあるのですか?

お礼日時:2011/02/24 20:02

実際、何を流したんでしょうね。

質問を読む感じだと、PCR産物というよりは、抽出産物をそのまま、って感じですが。その誤差でゲノム全長ってことはないでしょうから、プラスミドだとは思うんですけど、もしそうなら、環状のままなのか、リニアライズしたのかも書かれてないですし。

流した産物の長さとか(ターゲット500bpで300bpズレてたら気になりますが、2000bpが2300bpになったところで、別に気にすることでもないですし)、理論値をどうやって出したか(つまり、それが正確にバンドの位置を表しているか)もこっちは分からないんですから、アドバイスのしようがないわけで。

つまり、何(長さ、形状、精製の有無)をどうやって(時間とか電圧とかゲル濃度とか)流して、何(マーカーだけ?ポジコンは?)と比較してズレてたのか、補足してくださいな。
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どこの領域を増やしたとか正確に分からないとはっきりと何も言えません。


それと、抽出したDNAを流したわけではないのですね。

80bpなんて誤差の範囲のような気がするのですが…。
アプライする量を変えたり何回流したりしてもそうなるのでしょうか?

ゲル作製時にゲルメーカーのコームが汚れていると泳動が少しおかしく
なることはあります。

又は、マーカーDNAのサイズが実際と異なるとか、

今回使った酵母や大腸菌のDNAの増幅領域の長さが、データベースに
載っているものとはたまたま違ったとかも考えられます。

良く分かりませんけど、
普通に実験がうまくいっていると考えると、理論値がおかしいです。
他の人がやってもそうだったりとか、マーカーやゲルとかを変えても
結果が同じとかなら特にそう言えます。
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Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Q電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

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エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

制限酵素のSTAR活性かもしれません。
STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。

Q吸光度の単位

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一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

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物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。


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