制限酵素でラムダDNAを切断したいのですが、上手くいきません。アドバイスをお願いします。

基質DNA:ラムダDNAのPCR産物
制限酵素:PstI(約1U)
反応時間:37度 1時間

基質DNAのPCR産物は約6000bpで、本来であれば、2000、1400、1300、1100、160、72bpの6つに切断されるはずなのですが、電気泳動して確認したところ短いフラグメントの160、72bpというのが見えません。何故でしょうか?

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A 回答 (5件)

こんにちは、



taketaketakeoさんの指摘に補足します。
エチブロで染色して確認してますよね。エチブロの発光強度は
DNAの塩基の量に比例します。そのため、2000~1100bpのは
見えても、160、72は見えないのではないでしょうか。
(例えばカタログに乗っているλ/hindIIIの泳動写真とかも
低分子量のフラグメントの発光強度が小さくなってませんか)
ロードする量を多くして、低分子量を分けるのに最適化した
ゲルで泳動して確認されたらいかがでしょうか。
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いろいろと原因が考えられますが、


 反応時間やユニット数は本来ならばほとんど関係ないとおもいます。酵素の活性が落ちているのでは?もしそうならば反応時間やユニット数を増やすのも手です。ただしあまり酵素の含有率を多くするのもよくないそうですので全反応液の10分の1までにしておきましょう。
 他に考えられるものとしてPCRがうまくいっていないことが考えられるのでは?PCR後バンド確認しましたか?プライマーが間違いなくともうまく増幅されないこともたまにあります。Taqの種類によってはエラーが多くなってしましますし。
 最後に。多分これが一番確率が高いと思うんですが、小さいDNA断片はなぜだか知らないのですがよくバンドが見えないものです。電気泳動するDNAの量をもと増やしてみてはどうですか?
とまあもっとも?らしくアドバイスしているんですが実は私は研究かけだしの4回生。実験って思ったよりうまくいかなくて先に進まないものですね。うまくいくはずのことがうまくいかないときのやるせなさ・・・お互い頑張りましょう。
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すでにお考えのこともあるかもしれませんけど。



反応時間は少し短いような気がします。
パーシャルになっていて見えないのかも知れません。
貧乏だったころ自分でマーカーを作っていたのですが、オーバーナイトできってました。

酵素をふやすのもありかもしれません。あとDNAが変なコンフォメーションをとっているかも知れないので、反応前に少し温度を高くして高次構造をほぐすと良いかもしれません。これはあまり期待できませんけど。

あと、流す量が少ないなんてことはありませんよね。上のバンドの量からしてしたのバンドは確認できる量なのですよね。

あとコントロールとしてラムダDNAの自体をダイジェストして流したらどうでしょう?おんなじところにバンド出ますよね多分。
どんな切れ方をするかわかりませんが、ちょうどそこにエラーがあれば切れませんよね。

思いつくままで申し訳ないですが、こんなところです。
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この回答へのお礼

アドバイスありがとうございます。
やはり気になるのは反応時間ですね。オーバーナイトで一度試してみます。

お礼日時:2001/07/18 16:39

 補足頂きありがとうございます。

ここからは私の推測になってしいますのでご容赦下さい。

 1 PCR産物の確認と回収は行われていますでしょうか?
   もとのDNAは市販のものですからほとんど疑う余地は無いですが、
   PCR産物を回収していると他のものコンタミも考えられますので、
   正確に回収できているか確認下さい。

 2 制限酵素もしくは他の物質のコンタミ
    学生実験などで良くある失敗ですが、他の制限酵素が混じっている
   場合や余分な物質が含まれている場合に上手く実験が出来ない事も
   有りますので、疑うとしたら、PstIの制限酵素か、DNA回収時の
   持ちこみを考えてください。切れていない事も考えられます。

 3 反応時間の長さ
    付着末端ではあまり無いと思いますが、平滑末端だと、酵素の失活後
   再度付着も考えられると思います。
    ただ、反応時間がこれで良いか定かでは無いですので確認した方が
   良いと思います。
    λDNAのマーカーで流すのも良いと思います。切れてなくて、
   長い状態のDNAがあるかもしれません。

 4 あとこの酵素の基本的な内容を確認するのも必要かもしれません。
   たとえば、ある伸長以下のものは切れないとかです。

  回答になっていませんが、アドバイスになれば幸いです。
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この回答へのお礼

>回答になっていませんが、アドバイスになれば幸いです。
いえいえとんでもないです。アドバイスありがとうございます。

メーカー(制限酵素販売)に問い合わせてみましたが、酵素のユニット数や、反応時間を長くするということを対策として言われました。
もう少し、実験をしてみます。

お礼ではなくて報告みたいになってしまって申し訳ありません。

お礼日時:2001/07/18 16:02

 まず始めに、非常に昔の事ですので色々と間違っていたらごめんなさい。


 
 まず、λDNAって電気泳動で指標になるマーカーですよね。
 これをこの様に作っているのですか?(すみません質問で返して)
 
 とっさに思いついたのは、流れきっているということは有りまんか?
 短いのは早く流れますので、電気泳動の時間が長いとゲルから出でって
 しまうと思うんですが。
 もし、マーカーと同時に流していて、マーカーの断片は残っているが、
 切断した断片が無いとしたら、まあ電気泳動の時間は良い事になりますから、
 考えられるのは、違う部位で切れているかですよね。

 もし上記(電気泳動の時間)で違う様でしたら、以下補足下さい。
 1 λDNAは市販ですか、独自に作成したものですか?
 2 PstIの切れ方はどのような方法で切れましたっけ?
   平滑末端 付着末端ですか?
 3 反応時間は1時間で宜しいですか?
 4 これは興味本位ですが、学生実験ですか?マーカーをこの方法で
   作っているんでしょうか?
  教えて下さい。

この回答への補足

補足させていただきます。
1 ラムダDNAは市販のものです。その一部約6000bpをPCRによって増幅しました。
2 PstIは付着末端で切れます。
3 反応時間については、お伺いしたかったうちの1つです。1時間ぐらいでいいのでしょうか?とりあえず、1時間で実験をしてみたのではっきりとはわかりません。
(すいません・・・)
4 学生実験でマーカーを作っているわけではありません。が学生です。

それと、電気泳動のときに流しすぎたのでは?ということでしたが、それは無いと思います。なぜなら、切断断片を確認するときにマーカーを流しましたが、マーカーのバンド(最小80bp)も確認できましたので、流しすぎでは無いと思います。
よろしく御願い致します。

補足日時:2001/07/17 19:33
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制限酵素EcoR1:5マイクロリットル
制限酵素Xho1:5マイクロリットル
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ここをとりあえず見てください

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=9626243&dopt=GenBank

ここでdisplayのなかからFASTAを選択すると
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?query_key=1&db=nucleotide&qty=1&c_start=1&uids=&dopt=fasta&dispmax=20&sendto=&from=begin&to=end&extrafeatpresent=1&ef_CDD=8&ef_MGC=16&ef_HPRD=32&ef_STS=64&ef_tRNA=128&ef_microRNA=256

配列をコピーしやすい画面になります
この配列を
http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
に行ってコピーするとマップが得られます

http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0030
ここをとりあえず見てください

あとここで配列が入手できます。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=9626243&dopt=GenBank

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Q「制限酵素によるDNAの完全な切断」の定義をおしえて下さい。

1) 制限酵素認識領域を含むDNAをPCRで増幅
  ↓
2) DNAを精製
  ↓
3) 制限酵素処理
  ↓
4) DNAを精製
  ↓
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  ↓
6) 1),3),5)のサンプルを電気泳動でチェック

というような行程で実験を行ったのですが、5)で1)と同様のバンドが検出されました。
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どなたか「制限酵素によるDNAの完全な切断」の定義をおしえて下さい。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

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ところで、今回のケースでは実は完全消化できていたけれど、PCRで全長の産物ができていたという可能性も高いと思います。たとえば、4塩基の5'突出末端を生じる制限酵素で切った場合、両端のプライマーから合成されたDNAは、3'末端が4塩基の相補配列になります。それがアニールしてDNAが合成すると完全長の鋳型となりますので、普通にPCRで増えてきます。

Qプラスミドの制限酵素切断

いつもお世話になっております。

TAクローニングからプラスミドを抽出し、制限酵素処理をおこなって発現ベクターへのインサートを調整する系の実験を行っております。

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使用している酵素はXmnIとHindIIIです。

以前に他の制限酵素を用いていたときは問題なかったのですが。

ユニット数、処理時間をいろいろ試してもまったく
改善がみられません。

プライマーデザインの問題も考えられるのですが
他に原因が思い当たられるかたがいらっしゃいましたらご教示お願いいたします。

Aベストアンサー

3 kbのバンドがベクターであるという確信がおありなら、由来不明の2 kbのインサートが入っていると言うことで、いくら消化の条件を検討しても出ないものは出ないのでは。

また、これも可能性が高いと思うのですが、3 kbはlinear化したベクター、2 kbは切れ残ったCCCで、インサートが入ったクローンではなかったというストーリー。
その2 kbのバンドは、未消化の時には見えなかったものですか?

また、未消化のプラスミドは未消化の空のベクターより移動度が遅くなっていますか?
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PCRはこわいです。クローニングがうまくいっていなくてもプレーティングセルに混ざっているライゲイション反応液や、環境中のコンタミからそれらしいものが増えてくることもあります。
PCRプライマーは目的の構造のプラスミドだけが増える、またはそれを区別できるようなデザインですか?

Q制限酵素の取り扱い

制限酵素を使った実験を行いました。
多くの制限酵素は-20℃で保存されており、チューブに加える時も温度を上げないように注意されました。
しかし、最終的には37℃(酵素の至適温度)で反応させています。
制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか?失活を防ぐためですか?しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います。

また、次のような操作は可能でしょうか?
(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。
(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。

どなたか教えて下さい。お願いします。

Aベストアンサー

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には拡散しません。一次的に酵素濃度と粘性が非常に高い部分ができ、非特異的な配列を切断する可能性があります。酵素を加えてよく混和するまで冷やして、反応が起こらないようにするのがよいのです。
>(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。
これも、スター活性の原因になり、非特異的な切断がおこる可能性があります。失活を早めることにもなります。

>(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。

実際上は、いけるかもしれません。しかし、凍結してしまうと酵素は多かれ少なかれ失活するので、切断効率が起こることは覚悟しておかなければならないでしょう。

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には...続きを読む

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それとSmaIは37℃での活性が30℃のときの半分くらいだったと思いますが、何度で反応しましたか? まあ、それにしたってたとえ活性が半分でも全く切れなくなることはないですけれど。

結局、考えにくいけれど可能性としては、
・SmaIサイトが実はない、あったけれどつぶれている。
・SmaIがとんでもない不良品(念のためλDNA標品などを消化してチェックしてみては)。


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