タンパク実験の初心者です。タンパク実験でリコンビナントタンパクを精製する際、なぜ可溶性画分だと精製しやすくて、不溶性画分だと精製しにくのですか??またインクルージョンボディとは具体的にどういう状態なのですか??原理がいまいち理解できていないのだと思います。すごく馬鹿な質問ですがよろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

こんばんわ。


組み換えタンパクの精製には通常カラムを用います。
(というのも、例えば大腸菌でタンパクを発現させても、不要タンパクが大量に含まれるため)
この時、目的タンパクが可溶性だとカラムを通すことができますが、不溶性だとカラムが目詰まりしてしまい、精製が困難になります。
No.1の方も書かれているように、タグ付きタンパクを精製する場合には、タグを認識する抗体をくっつけたカラムを用い、例えば抗体を精製する場合は、抗体のイムノグロブリンを認識・結合するようなカラムを用います。

インクルージョンボディとは、例えば大腸菌で酵素などを発現させたときに、その酵素により自己分解されるのを防ぐために、大腸菌が酵素の構造を無茶苦茶にする、というものです。
というのも、一般的に酵素などのタンパクは立体構造が大切であり、これが崩れるとその酵素学的性質を失うということに由来しています。

こんな感じでOKかしらん?
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多くの場合、精製のやりやすさを考えて、タグとなるタンパク質を融合させたものを発現させます。

GST, MAL, His-tag, FLAG-tag, HA-tag, などなど、いろいろなタグがありますが、それぞれのタグには特異的に結合するカラムがあります。大腸菌のライセートを、そういうカラムに通してやると、目的のタンパク質だけがきれいに回収できます。
ところが、融合タンパク質が不溶性だと、カラムに通すことができません。尿素などで、可溶化できることもありますが、手間が増えますし、概して、可溶化させたタンパク質では、カラム精製の収量や精製度がよくありません。また、プルダウンアッセイに使うとか、ちゃんと活性をもったタンパク質を得たいとか、あと用途を考えると可溶性の方がいいのです(抗体をとるための免疫抗原にする場合は、インクルージョンボディをそのまま使ったりしますけど)。

インクルージョンボディは、高発現したタンパク質がめちゃくちゃに折り畳まれ絡み合った状態です。偏光顕微鏡や位相差顕微鏡で見ると、菌のなかにつぶつぶの結晶様に見えるそうです。分解・排除できない異物タンパク質から身を守るためのある種の防御機構と考えられます。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございました。すごくわかりやすかったです。また自分でいろいろと勉強していきたいと思います!

お礼日時:2005/04/21 23:49

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Aベストアンサー

こんにちは。

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I still got another 10 minutes to go!
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(1) Xタンパク質はヒトでは可溶性のタンパク質である。大腸菌の中で発現させると不溶化したのはなぜか
(2) Bさんはなぜ低温で発現させると改善されると考えたのか
(3) 尿素で可溶化し、透析することで何が期待されるか

以上の問題を解答お願いします。

Aベストアンサー

レポートの課題とかの可能性が高いので回避した書き方をします。

(1)そもそもヒトのタンパク質が大腸菌内でヒトと同様に発現することのほうが少数派で、出題者が求めている答えほど単純な理由じゃないような気もするので、あえて答えるなら”大腸菌で発現させているから”。
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(3)高濃度の尿素中でXタンパク質はどうなりますか。

イメージはあらかじめ折り跡のついた折り紙を折る感じです。

Q英語バカな私ですが毎日25分英会話してます

英語バカな私ですが毎日25分英会話してます
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毎日英語に触れるのは大切だと思うんですが、皆さんのアドバイスお願いしますm(_ _)m

Aベストアンサー

あなたはすごく謙虚な方なんですね。でも絶対「バカな私ですが」と言わないで/思わないでください。あなたは自分の目的を知っている、たいへん立派なことですしたぶん人間としても優れていると思います。

「文法はバラバラで」最初はそれでいいんです。私の友達のイギリス人はロシア人と結婚して今彼女の両親が一緒に住んでいて彼が一番嘆くのはそのお父さんの発音と正しい文法で話そうとすることです。 Would you please hand me a hammer.  と言われても発音が悪くて解からない、だから hammer とだけ言ってくれたら解かるのに、といつも嘆いています。

単語はできるだけ増やすこと。一番大切なことです。昔私はアメリカに来て引越しの際、英和・和英辞書を無くしたので英英辞書だけでした。それで結構英単語を自然に覚えました。今はインターネットで、また、日常、文化、政治、経済、文学なんでも英語で探索して読むと結構知らない単語に出くわしましたが、使いたいと思う文章だけを覚えました。読書する暇がないので30分位で全てを知りたいときは ”summary” とか “abstract” に本の題名をつけて探索 たとえば ”summary Of Mice and Men” と入力。誰かがシェークスピアのことを言ったら私は家に帰り次第すぐに探索、また時間を省くために“Shakespeare paraphrase” をキーワードで探索、ハムレットでもソネット(詩)などが 原作が左に現代化した英文が右に載ります。または日本のことを外人に伝えるのに英語で探索 たとえば“What is enka” と、そしてその中から演歌について2文章くらい覚える。会話は文法より日常なに起こっていることとか、知識的なことを広範囲に知ることです。どんなに文法を知っていてもそういう予備知識がないと話にいきずまってしまうんですよね。

「TOEIC点をあげたいのと留学したいのを」と言うことに付いては私にはそういう経験がないので何とも言える権利はありません。アメリカで技術的な仕事だったら技術さえ優れていたら英語が出来なくても大目にみてくれます。私はそれほど学歴はありませんが少し学校でほとんど独学で技術を身につけインタビューで 「他の人より2・3倍の仕事ができる。英語は出来なくても図を書いてでもコミュニケーションできる自信がある」 と言って世界指折りの会社にシステムエンジニアのポジションを得ました。昔の話です。

目的を達成するためにがんばって。辛抱です。インターネットで探索次第で無料の良い英語のチュートリアルのサイトが沢山見つかります。私は今までびた一文お金を使ったことありません。

あなたはすごく謙虚な方なんですね。でも絶対「バカな私ですが」と言わないで/思わないでください。あなたは自分の目的を知っている、たいへん立派なことですしたぶん人間としても優れていると思います。

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Q大腸菌での細胞膜タンパクを可溶性画分から回収するにはどうすればよいでしょう?

約60KDaの一回膜貫通型のタンパクをBL21で発現させようと思っています.

うちの研究室はもともと遺伝子とかタンパクには縁のない研究室なので、大腸菌およびプラスミドなどを扱っている人がおらず、独学で研究しています.
ゆえに、ほとんど人に相談することもできず四苦八苦しております(汗)

目的は、タンパクの全長かつタグフリーの状態で回収することです.

現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているようで(ウエスタンブロットで確認済み)なかなか可溶性画分から目的の回収量(できれば数 mg)に至りません.(10L cultureで200 ug程度)

また、最終的にGSTタグをグルタチオンカラムに保持した状態でのプロテアーゼによる切断を行ったのですが、どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

このような状態なのですが、なにかよい解決法があれば教えて下さい.
ちなみに、inclusion bodyからのリホールディングをスモールスケールで試してみたのですが、アルギニンと酸化型グルタチオンがないと凝集が起きやすく、またコストも馬鹿にならないように感じました.
(研究テーマが研究室のメインとはややズレており、なかなか研究費が降りないため、できうる限り低コストな策があればありがたいです)

また、目的タンパクの性質(pKa、親水性?疎水性?、立体構造など)を調べる方法やソフトがあれば教えて下さい.
ちなみに、Protein Data Bankで調べてみましたが、残念ながら登録されていないようでした.

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現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているよ...続きを読む

Aベストアンサー

>10L cultureで200 ug程度

大腸菌は外来膜蛋白が嫌いです。200 ug程度は上々です。うまくいかないほうが普通です。

>どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

マイルドなデタージェントは入っていますか?NP40、Triton X-100など。どこに行ってしまったか、分解してしまったかは、チューブの壁にくっついていることも考えに入れて、SDSで洗って検討できるかもしれません。

Q英語で「ポイント利用分」はどのように?

英語で「ポイント利用分」はどのように?

サービス業です。

領収書発行時に「ポイント利用分」と
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を記したく思っています。
「ポイント利用分」はどのような英文がよいでしょうか?
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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

ポイントを利用して支払いをした ということですか?

わかりやすいのは その金額の横に 
paid by points. 書くのがいいと思うのですが、どうでしょう?

アメリカで言うところのマイレッジ=mileage ですね。

残っているポイントは balance of your points = **** points.
利用できるポイントは available points
獲得ポイントは earned points

で意味はわかるはずですが。

Q不溶性蛋白の可溶化(組み換え蛋白の発現)

いつもお世話になっております。

組み換え蛋白をGST融合蛋白として発現させる系をおこなっております。
目的の蛋白が不溶姓にでてくるのですが、これを可溶化させるために次の方法を考えております。

1、界面活性剤を用いて再可溶化
2,cold発現ベクターでの発現

これ以外にこうやったら可溶化したよ、という方いらっしゃいましたらお教えいただけたら幸いです。

最初の可溶化はPBSにリゾチームを添加したもので凍結融解を10回くりかえして行っています。

Aベストアンサー

融合タンパク質をどのような目的で使うかによっても、好みが違ってくると思います。
私はこれまで収量重視の実験が多かったものですから、不溶性になってもあまり気にせず、目一杯発現誘導していました。しかし、Pull-down assayやGel-shiftのような実験をやっていた同僚たちは、たとえ収量を犠牲にしても、最初から可溶性になるように発現させる方法を選んでいました。たとえば、低温で発現誘導する、Periplasmに分泌されるとかthioredoxinと融合させるとかの宿主/ベクター系を使うなどです。

不溶化してInclusion bodyを形成してしまい可溶化する必要がある場合私はこうしています(出典はMolecular Cloningだったと思います)。
1. Inclusion bodyを蒸留水、またはPBSなどにピペッティングなどで懸濁、遠心。1~3回繰り返し可溶性成分を洗い落とす。

2. 沈殿に少量の10 mM EDTA (pH8)を加える(1L培養につき2 mL程度)

3. 等容量の8 M尿素を加え、30分間ステア。溶けがわるいようなら、さらに8 M尿素を加える。ここでTx100, Tween20などの界面活性剤、DTT、適当なpHのバッファーなどを加えると効果的な場合がある。

4. 遠心して不溶物を沈殿させ、上澄みを回収。

5. 2 M 尿素/5 mM DTT/0.2 mM EDTA→PBS(数回)で透析。または、アフィニティーカラム精製で許容できる尿素濃度(タグによって異なる)まで希釈してカラム精製(カラムの中で尿素濃度が下がると、そこで不溶化するおそれあり)。

界面活性剤は、透析で取り除きにくいので、界面活性剤が用途に影響がある場合は入れない方がいいでしょう。
逆に、界面活性剤が混在していても影響がないような場合は、溶菌するのに使ってもいいと思いますよ(凍結融解は、手間でしょう)。

融合タンパク質をどのような目的で使うかによっても、好みが違ってくると思います。
私はこれまで収量重視の実験が多かったものですから、不溶性になってもあまり気にせず、目一杯発現誘導していました。しかし、Pull-down assayやGel-shiftのような実験をやっていた同僚たちは、たとえ収量を犠牲にしても、最初から可溶性になるように発現させる方法を選んでいました。たとえば、低温で発現誘導する、Periplasmに分泌されるとかthioredoxinと融合させるとかの宿主/ベクター系を使うなどです。

不溶化してInc...続きを読む

Qセンター英語 第問6を10~15分で読むことってできますか?

特に最近は1000語を越えてますが、10分で読むというのはさすがに無理でしょうか?

センター英語を40分で9割をとった人がいるようなので・・・

こんな人ってどこで時間短縮してるんだろう?と疑問に思ってしまいます。

Aベストアンサー

センター程度の内容なら1000語を10分はそれほど難しいことではない。ネイティブには完全に劣る今の私でさえもその程度は10分以内で読める。


>やっぱりここらへんのレベルは東大生や早慶の人らにとっては
>普通のことなんでしょうか?

人次第。英語が苦手なら東大生でも10分で読めない人もいるだろう。


>センター英語を40分で9割をとった人がいるようなので・・・

英語が得意なら簡単な話。
自身は留学経験も無いが受験生に英語を教えている親族が、毎年センターの問題を解いているが、だいたい30分程度で説き終わってほぼ満点。
その人は東大や早慶卒ではなかったと思う。

Q【NO!動物実験】「NO!動物実験」をどう思いますか? LUSHのNO!動物実験運動のことだと思いま

【NO!動物実験】「NO!動物実験」をどう思いますか?

LUSHのNO!動物実験運動のことだと思いますが、

医療の発達は動物実験なくしては無理ですよね?

皮膚の炎症を抑える治療法や治療薬は猿の遺伝子操作して意図的に皮膚炎になった猿を人口的に作り出しその猿で治療法、治療薬を作ってきた。

もし動物実験がダメなことと言うなら自分が皮膚炎に掛かったときに、これ動物実験できなくなったから試してないけど塗っていい?と言われたら人間が実験台になる人間実験の時代になるわけですよね?

動物実験と人間実験。

動物愛護の人は人間より動物を優先するのでしょうか?

人間実験始めますって言ったらどうするおつもりですか?

よかった。動物実験がなくなって動物愛護法ができて良かった。

でも人間の実験を人間で行う人体実験は人権侵害、人間保護の精神は動物愛護の人にはないのでしょうか?

人間と動物どちらかで実験しないといけないと言われたら動物を差し出しますよ。私は。

動物愛護の人はあなた、動物、他人がいたら他人を実験台に差し出すってことですよね。

怖すぎます。

NO!動物実験にNO!です。

【NO!動物実験】「NO!動物実験」をどう思いますか?

LUSHのNO!動物実験運動のことだと思いますが、

医療の発達は動物実験なくしては無理ですよね?

皮膚の炎症を抑える治療法や治療薬は猿の遺伝子操作して意図的に皮膚炎になった猿を人口的に作り出しその猿で治療法、治療薬を作ってきた。

もし動物実験がダメなことと言うなら自分が皮膚炎に掛かったときに、これ動物実験できなくなったから試してないけど塗っていい?と言われたら人間が実験台になる人間実験の時代になるわけですよね?

動物実験と人間実験...続きを読む

Aベストアンサー

詳しいことを読んでないですよね?
今まで化粧品をうさぎの目に垂らすという実験が行われていたのですが、それは人間の肌に有害かどうかを裏付ける物ではないとの科学的結果が出たのです。
だから、無駄に動物をいためつける実験はやめようと言っています。
例えば新薬のマウス実験をやめようとは言っていないです。

Q英語で1語で「分の歩き」とは?

英語で1語で「分の歩き」とは?

Aベストアンサー

「歩いて10分の距離」を
(a) ten minutes' walk
a ten-minute walk
と表現できます。

walk に「歩行距離」という意味合いがあるのです。

10分の歩き
と言い換えて,10 は ten
残りは「分の歩き」ですが,これで1語でなく,
ten-minute で一語となります。

a ten-year-old boy「10歳の男の子」という表現もありますが,
数字 - 単位となる単数名詞
という形です。

Qタンパク質の精製

タンパク質の精製をカラムのどでする際に、グラジエントに塩を用いますよね?
塩濃度をあげることによって、タンパクの溶解度、又は目的タンパクと不純タンパクとの結合力の低下によって、分離できると聞きました。
その理由は何なのでしょうか??
なぜ溶解度が上がったり、結合力が落ちたりするのでしょうか??
どなたか教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

目的のタンパク質が正の電荷(プラス)だったら、カラムは負の電荷(マイナス)を使用します(逆も可能)。
この場合、NaCl溶液中の正の電荷を持ったNaイオン(プラス)が関係します。

イス取りゲームを想像してください。

イスがカラム。

座る人が、正の電荷を持ったタンパク質とNaイオン(NaClは溶液中では電離)。

最初は、塩を含まない溶液中で、イスにタンパク質を座らせます。
よくモノが「結合する」と言いますが、実はずーーと結合しているのではなく、結合している「時間が長い」もしくは「確立が高い」状態を
我々は「結合している」と言っているのです。
つまり、物質は常にくっついたり離れたりを繰り返しています。

さて、最初に戻って、イスにタンパク質を座らせます。この時、座っていると言っても、「座っている時間が長い」という状態です。
なので、見かけ上、ずっと座っているように見えます。

その状態でいるところに、もう1つ、イスに座ることができるNaイオンを入れてやります。

すると、数が限られたイスをタンパク質とNaイオンが取り合うことになります。
より「結合力が強い」タンパク質は「イスに座っている時間が長くなります」。
このとき、塩溶液は流れているわけですから、Naイオンとイスを取り合った結果、
イスに座ることが出来なくなった(イスに座る時間が短くなった)タンパク質は、しがみつくことが出来なくなるので、流れて行きます。

それで、塩溶液の濃度をどんどん高くすると、タンパク質をイスを取りあるNaイオンの数が多くなります。
すると、タンパク質は確率的にNaイオンよりイスに座りにくくなり、
元々イスに座ることが出来る力が強いタンパク質も座ってられなくなって、ついには、流れて行きます。

この、タンパク質とNaイオンのイス取りゲームをさせることで、イスに座る力が弱いタンパク質から順番に流れさせることで精製を行うのが
イオン交換クロマトグラフィーなのです。

タンパク質同士の結合の場合は、タンパク質中にあるイスをタンパク質が座るか、イオンが座るかという競争が起こります。
これもイオンが多いほど、タンパク質同士の結合を抑えます。

こういう風な「競争」を「競合させる」といって、生物学の実験ではよくやる手法です。
ドミナントネガティブとか、ある物質を大量に入れて機能を阻害するなど、上記の競争している想像は役に立つと思います。

>タンパクの隙間に塩は簡単に入りこめるものなのでしょうか??
タンパク質に比べてNaイオンとかは小さいと思うので、ある程度は入り込むのではないでしょうか・・・。
ここは曖昧です。詳しい人にお任せします。

目的のタンパク質が正の電荷(プラス)だったら、カラムは負の電荷(マイナス)を使用します(逆も可能)。
この場合、NaCl溶液中の正の電荷を持ったNaイオン(プラス)が関係します。

イス取りゲームを想像してください。

イスがカラム。

座る人が、正の電荷を持ったタンパク質とNaイオン(NaClは溶液中では電離)。

最初は、塩を含まない溶液中で、イスにタンパク質を座らせます。
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