今度実験でcDNAライブラリーからDIGをもちいてプローブを標識してスクリーニングを行おうと思っているのですが、失敗しない方法や検出機器について教えてください。
それからRIを用いないプローブのラベルで他に良い方法があればそれも教えてもらいたいです.おねがいします。

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A 回答 (2件)

次の成書は参考になりませんか。



「実験プロトコールシリーズ 脱アイソトープ実験プロトコール 1.DIGハイブリダイゼーション」(秀潤社)
 詳細は下のペ-ジからご覧下さい。

その他,このぺ-じにある各種の実験書には記載のあるものもあると思います。

参考URL:http://www.shujunsha.co.jp/saizb.html
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この回答へのお礼

ありがとうございました。
さっそく読んでみます。

お礼日時:2001/12/17 19:52

以下の参考URLサイトは参考になりますでしょうか?


「核酸のハイブリッド形成」
http://jfly.nibb.ac.jp/html/discussion/9508_Sali …
http://ikushmc8.bio.mie-u.ac.jp/homepage/Protoco …
(DIGラベルDNAプローブの調製)
http://www.mic.med.tohoku.ac.jp/98april/98april1 …
(メンブレンのハイブリダイゼーション)

ご参考まで。

参考URL:http://gtc.gtca.kumamoto-u.ac.jp/staff/~masa/ls9 …
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QcDNAライブラリーのスクリーニング

このときに必要な条件で
1.スクリーニングするときに何らかの既知の情報が必要
2.保存性の高いところをスクリーニング
と、あるのですが、まだ、学び始めたばかりで、良く分からなくて困ってます。

Aベストアンサー

スクリーニングについてはこちらを
http://www.mic.med.tohoku.ac.jp/98april/98april1/biology/screening1.html

1.何らかの既知の情報とは、cDNAのライブラリーからつってくるわけですから、DNAやら、アミノ酸配列やらがないとプローブが出来ないわけです。

保存性の高いところというのは、1とも関連しますが、既にいくつかの別種で配列がオープンになっていて、自分がとりたい種でとる場合(カウンターパート)、もしくは、アイソフォームの情報が分かっている場合はそこを狙います。いくつかの種で保存性が高いものであれば、今からとろうとするものでも同じ=保存されている可能性が高いからです。(そんなに特殊な用語は用いていないので適宜調べてください)

他にも、オーバーラップの少ないコドンを使うとか、コドンの使用頻度の話とか、ハイブリの条件(温度等)をかえるやら出てくると思いますが、考え方はそんなに難しいものではないですので、多々発売されている本をごらんになられてはどうかと思います。

QゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違い

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よろしくお願いします

Aベストアンサー

まず、DNA=遺伝子ではないということと、「遺伝子<ゲノム」なのを考えればわかると思いますが、ゲノムライブラリーは、ゲノムを制限酵素で切断したもの全てをライブラリー化したものです。つまり、遺伝子だけでなく、遺伝子ではない部分も取り込みます。
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つまり、遺伝子のタンパク発現・機能解析を行いたい時に、cDNAライブラリーを用いる場合が多いです。
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QcDNAライブラリー 標識

cDNAライブラリーの作製方法を色々見ていると、Size Fractionatingのために放射性活性物質を用いた標識を行っていますが、
1,放射性活性物質でないとダメなのでしょうか。
2,標識は必ずしなければならないのでしょうか。(つまり、どうせ電気泳動でバンドを確認するのであれば、通常どおりの泳動をしてエチブロで確認、というのはダメなのかということなのです)
基本的な事なのかもしれませんがどうしてもわかりません。
どなたか教えて下さい。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

私も最初はマニュアルどおりRIを取り込ませてcDNAライブラリーを作成していましたが、後にはRIなしにしました。

RIを取り込ませる理由は
1.逆転写、セカンドストランド合成の効率をモニターする。
2.少量を泳動して適当なサイズのcDNAフラクションを選ぶ。
3.cDNAの収量を計算して、適当なベクター:cDNA比を得る。
の3点です。
逆に不利な点は、RIの崩壊、β線の放出によって、cDNAが壊れていくので、速やかにライブラリーを完成させて大腸菌で増幅しないと、どんどん質が悪くなっていくことです。しかし、これをnon-RIラベルにするのは、cDNAの化学構造を変えてしまうことになるので、いい考えではありません。

1)では特に逆転写の効率がRNA純度などによって振れやすく、ここがうまくいっていないと良いライブラリーが作れないので取り込み量のモニターは重要でした。しかし、最近は各社が競って、良いRNA精製システムや、高性能の逆転写酵素を出していますので、ここの効率が悪くて失敗するということもそれほどないと思います。セカンドストランド合成は、活性が影響を受けにくいPol Iの反応で、サンプルによる振れは気にしなくて良いです。

2)では、極端に短いcDNAを排除するのが目的ですが、フラクションをいくつもとらなくても、低分子量をカットオフするexclusion gel filtrationで充分です。サイズを確認せずにeluateをそのまま使えばよいです。また、Syber Greenなど高感度の検出試薬を使えば、電気泳動で確認することも可能です。

3)はEtBrやSyber Greenなどをつかったスポットテスト(Molecular Cloningに出ているサランラップ法)による定量で代用できます。また、適当な宿主ーベクター系を使えばnon-recombinantを排除できますから、比を気にせずにベクター過剰にして、一発勝負でやってしまうというのもありでしょう。

やはり微量なサンプルだとだとRIを使うほうが有利だと思いますが、RIなしでもできないことではないです。
その場合、できれば、スタートのRNAの量はシステムが許す上限ぎりぎりまでふやしたら良いですね。

私も最初はマニュアルどおりRIを取り込ませてcDNAライブラリーを作成していましたが、後にはRIなしにしました。

RIを取り込ませる理由は
1.逆転写、セカンドストランド合成の効率をモニターする。
2.少量を泳動して適当なサイズのcDNAフラクションを選ぶ。
3.cDNAの収量を計算して、適当なベクター:cDNA比を得る。
の3点です。
逆に不利な点は、RIの崩壊、β線の放出によって、cDNAが壊れていくので、速やかにライブラリーを完成させて大腸菌で増幅しないと、どんどん質が悪くなっていくことです。...続きを読む

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緑藻クラミドモナスのcDNAライブラリーを作成しようと思い、羊土社の遺伝子工学実験ノート上を参考にして操作を行なったところ1stストランドの段階で逆転写反応がうまくいっていないようです。クラミドモナスのmRNAはGCリッチで高次構造をとりやすいのでそういったことも関係しているかもしれません。どなたかこのような問題を解決するよい方法やクラミドモナスのcDNAライブラリーはこのように作ったらいいなどのアドバイスがありましたら教えてください。お願いします。

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作製キットのマニュアルがメーカーのホームページから入手できますので、熟読をお勧めします


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