【復活求む!】惜しくも解散してしまったバンド|J-ROCK編

研究室配属された大学生です。今度、初めてRNAをポリアクリルアミドで流すことになったんですが、その際注意することはどのようなことですか?

例えば、ゲル作成でつかう水はオートクレーブ済DEPC水を使えばよいのか、よいのでしょうか?DEPC水を使って泳動には影響しないでしょうか。それともオートクレーブ済Mill-Qでよいでしょうか。

またサンプルにRNase inhibitorなど入れる必要はあるのでしょうか。

よろしくお願い致します。

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A 回答 (6件)

No.4です。


サイズで分離するのであれば、尿素を使うのが妥当です。なぜなら尿素は核酸の高次構造を壊すのに有効です。SDSで完全に核酸の高次構造を壊し、サイズで分離する方法は私の知っている限り樹立されてないと思います(もしかしたら特殊な方法があるかもしれませんが)。特に核酸は高次構造を壊さないとサイズによって泳動されずに、予想のつかない位置に現れることがかなりあります。ライブラリーということですからシーケンスによって違う位置にバンドが現れると全部を回収できない恐れがあると思います。尿素を使うときは、SDSはrunnnig bufferに入れない方がいいとおもいます。
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miRNAでしたら、7M(か8M)尿素入りの15%位のポリアクリルアミドゲルでやりますね。


切り出すのならビスの量を減らすと良いらしいですが自分は普通の19:1でしかやったことがありません。
runnnig bufferは1xTBEで、ローディングbufferに尿素かホルムアミドを入れます。
熱変性は短いRNAなのでしてもしなくてもあまり変わらないと予想されます。
溶出は複数回やれば回収率が高められます。

水はmilliQでまったく問題ないです。(ラボによるでしょうけど)
オートクレーブはRNaseを完全に不活性化することはできないので気休め程度だと思います。
RNA精製をきれいにやれば平気なはずです。

参考URL:http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ …
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尿素を使ったRNA(核酸)の電気泳動ではサイズによる分離がかなり正確にできます。

水はきれいであれば尿素がはいっているので分解を気にする必要はないとおもいますミリQから直接取った水かそれをオートクレーブしたものでいいと思います。たぶん正確なサイズに基づいて分離するならローディングバッファーにフォルムアミドが入っているし熱変性もすると思いますのでRNase inhibitorまで必要ないと思います。入れても泳動中は分離されてしまうでしょうし。
in vitro transcriptionで合成したRNAの精製でしょうか?それなら尿素を使ったRNA(核酸)の電気泳動(PAGE)が一般的です。
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この回答へのお礼

おはようございます!
丁寧なご回答誠にありがとうございます。
実は、植物のmiRNAのライブラリーを作成し、スクリーニングを行う予定です。

手順としては、まずRNAを抽出し、それをPAGEで分離し、低分子のみをゲル抜きしてクローニングします。

その際のRNAの電気泳動についてお聞きしたく、質問させていただいた次第です。説明不足で申し上げございません。
この場合、SDSより尿素を入れるべきなのでしょうか?
またrunnnig bufferはSDSが入っていないものを使うべきでしょうか?
何卒よろしくお願い申し上げます。

お礼日時:2006/05/19 10:00

No.1です。

変性剤で尿素は使ったことがありませんね。
私のRNAの泳動は分節パターンをみるためでしたのでRNAを回収する目的ではなかったので特に意識はしていませんでした。
Native-Pageをやってみるというのも手かもしれません。
変性は蛋白の変性が目的なので核酸の泳動には必要ないのではないかなあというのが私見です。
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泳動後に RNA をゲルから回収するなどでしたら細心の注意も必要でしょうが


私は脱イオン水をオートクレーヴしただけの水を使っています。

分生の一般的なプロトコルは集めておきましょう。
http://www.google.co.jp/search?num=100&hl=ja&q=% …
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この回答へのお礼

ご回答誠にありがとうございます。
実は、泳動後ゲルから切り出します。

お礼日時:2006/05/18 18:37

かつてRNAをSDS-PAGEしたことがあるものです。


ゲル作製時にはそれほど気をつけることはありません。(蛋白質の泳動はされたことがありますか?)
蛋白質のPAGEと同様にゲルを作製していましたが、泳動結果に問題はありませんでした。
ゲル作製時に用いる水はオートクレーブ済みのMili-Q水です。
サンプルにもInhibitorはいれていません。
注意してサンプルを扱えば問題はないと思います。
御自身の技術に不安があるようならRNAを抽出する際にInhibitorをいれておけばよいのではないでしょうか?

私が一番気をつけていたのはサンプルのRNAを抽出する際です。アルコールをしっかりきっておかないとアプライ時にサンプルが沈まずにういて拡散してしまいますのでその点だけ注意していました。他人の抽出したRNAを使っていたのですが、このヒトがアルコールをちゃんと切らないヒトだったので何度泳動やりなおしたことか・・

乱文ですが・・がんばってくださいね。
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この回答へのお礼

ご回答誠にありがとうございます!!かなり助かりました!
そこで、また質問なのですが、RNAを泳動する場合、変性剤はSDSより尿素の方の方がよい気がするのですがどうなのでしょうか??

お礼日時:2006/05/18 16:33

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