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トランスジェニック初心者です。
今、組織特異的ノックアウトについて勉強しています。
すんごく基本的なことがわからず、学校の先生に聞いてもわかりませんでした。

トランスジェニックの以前の問題なのですが・・・
例をあげると、心筋に特異的なαMHCのプロモーター以下にあるカドヘリンのエクソンをCre-loxPで欠失させるというものなのですが、カドヘリンの遺伝子というのはもともとαMHCのプロモーターにあるものなのでしょうか?
カドヘリンというのは全身のいたるところで発現していると思うのですが、カドヘリンをコードしている遺伝子というのはいろんなプロモーターを持っていて、それぞれの組織特異的なプロモーターの下にカドヘリン遺伝子がコードされているのでしょうか??
本当にわかりません!よろしくお願いします。

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A 回答 (4件)

(;^_^A


D, Western blot analysis of heart and brain lysates demonstrates no change in N-cadherin protein levels in floxed animals. GAPDH signal shows loading of samples between lanes.
まず、このfigureの説明は、conditional KOのマウスでも野生型と同じようにN-Cadの発現が変わらないと言いたいのですよね。つまりここで言うbrainのN-cadの発現は、人為的に発現させたのではなくて、内在の発現で、まったくのコントロールですよね。遺伝的に何ら影響を受けないはずの。ここまでいいですか?で、なぜ発現しているかと問われれば、脳に特異的なエンハンサーまたはプロモーターがN-cad本来の遺伝子に存在し、その活性を利用して「普通に」発現しているものと思います。ここで導入しているαMHCのプロモーターはcreを外から(exsogenous)心筋特異的に発現させる為に用いたプロモーターで、内在のN-cadの発現には何ら関係ありません。
「私が不思議なのが、なぜαMHCのプロモーターが関与しない脳でもカドヘリンが発現できるのだろう?」実験で発現させているのではなくて、もともと発現しているということを誤解されているか、MHCプロモーターというのがN-cadのプロモーターと思われているかどっちかだと思うのですが、この説明でわかりましたでしょうか?
例えばMHCプロモーターで心筋特異的だったので、今度は脳に特異的なプロモーターを使えば、このプロモーターにcreをつないで作ったベクターを導入したマウスとこのn-cad cKOを掛け合わせれば脳特異的にKOしたN-Cad KOマウスが作れますよね。どうでしょう誤解が解けたでしょうか。
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この回答へのお礼

Dr_Hyperさん
本当にありがとうございました!すっきりと納得できました。
Transgenic動物に今までまったく関わったことがなく、しかも研究室内でTransgenicについて詳しい人がいなかったので、非常にDr_Hyperさんの意見がありがたいです!これからもがんばって勉強していきます!

お礼日時:2006/11/23 22:23

No1です。


カドヘリンにはサブタイプが数十種類あるようです。
あなたがターゲットとしているカドヘリンサブタイプのプロモーター領域については、個別に検索するしかないでしょうね。
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あなたの書かれている「筋に特異的なαMHCのプロモーター以下にあるカドヘリンのエクソンを」は、トランスジェニックによる過剰発現と組織特異的ノックアウトが混同しているかのように読めます。


「αMHCのプロモーター以下にあるカドヘリン」を導入することで、心筋特異的な過剰発現による解析(gain of function)ができるのと、
「カドヘリンのエクソンを(αMHCのプロモーターをもちいて)Cre-loxPで欠失させる」(loss of function)ことによって、この(サブタイプの)カドヘリンの機能を明らかにする。のではないでしょうか?
組織特異性の低いカドヘリンの単純なノックアウトやトランスジェニックだといろんな形質が出てしまうので、過剰発現と欠失をαMHCのプロモーターを用いて心筋特異的に両方向からしらべる。ということではないでしょうか。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
確かにDr_Hyperさんのおっしゃているとおり、勘違いしていると思います。
ちなみに、私が言っているカドヘリンはN-カドヘリンというサブタイプです。質問の内容を使っている論文(Induced Deletion of the N-Cadherin Gene in the Heart Leads to Dissolution of the Intercalated Disc Structure
Circulation Research, 96, 346, 2005
)を読んでいます。
まだ分からないことがあって、上の論文ではCre-loxPを使ってN-カドヘリンを条件付ノックアウトする前に心臓と脳でのN-カドヘリンの発現をチェックしています。そして、脳でもN-カドヘリンが発現しています。ここで、私が不思議なのが、なぜαMHCのプロモーターが関与しない脳でもカドヘリンが発現できるのだろう?ということです。もしよろしければご回答ください。本当にありがとうございます。

お礼日時:2006/11/23 18:40

この場合、カドヘリンのプロモーターは関係ないのでは?



方法は、カドヘリンのexonをloxPではさんだマウスと
αMHC-Creをもつマウスを掛け合わせれば
心筋特異的なノックアウトマウスが作れますよね
またCreを、心筋特異的に発現させるようなアデノウイルスに仕込んでもいいのかと思いますが。
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この回答へのお礼

回答をありがとうございました。

αMHCが心筋にしか発現しないので、心筋でのカドヘリンの発現がノックアウトされるとなくなるのはわかるのですが、
では、どうして、αMHCのプロモーターの関係のない組織でカドヘリンが発現することができるのかがわかりません。カドヘリンのexonがなぜαMHCが翻訳されないところでも翻訳され、発現できるのかがわかりません。もう、トランスジェニック以前の問題だと思いますが、回答をいただけるとうれしいです。

お礼日時:2006/11/23 15:19

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よろしくおねがいします。

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実際の現場では、トランスジェニックは、特に外来の遺伝子を染色体上の不特定の場所に挿入させることをさします。たとえば、ある変異の原因遺伝子がこれであるということを証明するために、正常な遺伝子を導入することで変異体の表現型が回復するかどうかを見るような場合に使います。マウスでは、受精卵にDNAを注射して、妊娠マウスに借り腹させて作成します。

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http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
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Aベストアンサー

1、サイバーGで各増幅回数ごとの二本鎖DNA量を測定する
(だから、後にどのような解析方法を行うとしてもfold inductionである)

ここからが「解析」に入るわけですが、、、
2、ハウスキーピングで値をノーマライズする。
(どのような解析方法を用いるにしても、この作業をしないと、
ハウスキーピングを増幅対象に用いた理由が生じ得ない)

そして、ハウスキーピングとの比率
あるいは異検体間の目的遺伝子の発現比率
あるいは一検体内での複数の目的遺伝子の発現量比率 を求めるために
3-1 二次微分で増幅開始ポイント(というのかな?)を決定してやる。
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(この方法は利点が少ないが、#1のような事例に対応できる)

という説明をしたつもりですが、私の知識量が足りないことによる理解不足で
かつ、それをあなたが説明することにより私から適切な回答が得られるとあなたが考えた場合は
あなたが補足説明をしてください。それ以外の場合は無視してください。

1、サイバーGで各増幅回数ごとの二本鎖DNA量を測定する
(だから、後にどのような解析方法を行うとしてもfold inductionである)

ここからが「解析」に入るわけですが、、、
2、ハウスキーピングで値をノーマライズする。
(どのような解析方法を用いるにしても、この作業をしないと、
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QRAW264.7マクロファージについて

RAW264.7マクロファージについての質問です。

免疫学関係の実験論文を読んでいてどう検索していいものか分からず、ここで質問させていただくに至りました。
マウス由来のRAW264.7マクロファージは、マウスのどの部分から抽出された細胞なのでしょうか。
どうして、炎症性のサイトカインに関するような免疫応答の実験では、この細胞を用いるのでしょうか。
なぜ、この細胞を使うことで免疫機能をみることができるのですか?

Aベストアンサー

これからいろいろな実験をする、または関連する論文を読むのかと思いますが、実験ではよく“細胞株”というものを使います。
細胞株についてはこちらをご覧ください。
また、その中の細胞株の樹立についてもご覧になるとよくわかると思います。
http://cellbank.nibio.go.jp/visitercenter/whatsculture/cellculture01.html

さて、RAW264.7はマウスの単球性白血病由来の細胞株です。

上記のHPの内容を理解していただければわかると思いますが、
実験を行うとき、ある細胞のある物質に対する反応や、ある細胞の動きをみたい場合、
その細胞を生体から取ってこなければならないということをするのは大変です。
その細胞の生体内での数が少なかったり、取ってくる作業によって性質がちょっとずつ違ったりなど。
その時に、不死化して同じような性質の細胞がたくさん得られるということで細胞株は大変有用なのです。

RAW264.7は単球の一部の分化能を持っています。それでサイトカインやLPSに対して反応します。
「得やすい」「一部の分化能をもっている」ということで実験に使いやすいのです。

しかしながら、がん由来の細胞株ですので、どの細胞株でも言えることですが、
正常な生体内にある細胞とは由来が同じであるというだけで完全に同じであるわけではないので、
きちんとした実験では、正常な生体内の細胞で実験を行う必要はあります。
生体内の細胞をprimary cellとか初代培養細胞とか言います。

これからいろいろな実験をする、または関連する論文を読むのかと思いますが、実験ではよく“細胞株”というものを使います。
細胞株についてはこちらをご覧ください。
また、その中の細胞株の樹立についてもご覧になるとよくわかると思います。
http://cellbank.nibio.go.jp/visitercenter/whatsculture/cellculture01.html

さて、RAW264.7はマウスの単球性白血病由来の細胞株です。

上記のHPの内容を理解していただければわかると思いますが、
実験を行うとき、ある細胞のある物質に対する反応や、ある...続きを読む


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