今さら周りの人に聞けないin situ probeの疑問

マウス胚でwhole mount in situをやっているのですが、probe合成でいつも疑問に思っていることがあります。それは、ハイブリダイズさせるためにanti sense probeを合成するのですが、なぜsense probeだとRNAにハイブリダイズされないのか？です。
anti sense probeをプラスミドから合成する時は、必ずインサートの5'側を制限酵素処理してリニアライズし、インサートの3'側からSP6とかT3 T7などの酵素でprobeを合成します。
でも逆にインサートの3'側を制限酵素処理してリニアライズ，インサートの5'側から合成したってハイブリダイズするんじゃないかと思ってしまいます。RNAは1本鎖だから。でも実際はそうではありません。
RNAに実際にどのようにprobeが反応するのかイマイチ分かりません。
手元にある本とかネットでも調べましたがありませんでした。
in situを始めて2年になって今さら、周りの人に聞けなくて。どうぞよろしくお願い致します。

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2007/01/07 19:03

ゲノム上の遺伝子は二本鎖DNAですが、そこから転写されるRNAは二本鎖DNAのうちの一方だけ（antisense strand）を鋳型にします。

転写産物であるRNAはsense strand（つまりmRNAの場合は、ORFをもつ鎖、遺伝子産物であるタンパク質を指定するコドンを持つ鎖）、それと相補な配列をもつ鎖がantisense strandです。RNAがsenseならそれにハイブリするのはantisenseであるのは、当たり前ですね。

この回答への補足

早速のご回答、どうもありがとうございます。
私の理解が悪くて申し訳ないのですが、
DNAから転写されるRNAは2本鎖DNAの一方だけですが、2本鎖のどちらを選んで転写しているのでしょうか？(なんか決まった法則とかあるのでしょうか？)
DNAから転写されたRNAに相補的な配列のprobeがハイブリダイズされますが、それは5'-----AAAA3'のRNAがあったとしてそれに相補的なanti sense probeは3'------5'ということですよね？
でも5'------3'で合成しても、ひっくり返せば3'-----5'となるわけでハイブリダイズされるのでは…？と考えてしまいます。
理解が悪くて申し訳ないです。よろしくお願いします。

補足日時：2007/01/07 19:09

No.2 回答者： geneticist12 回答日時： 2007/01/07 20:27

>でも5'------3'で合成しても、ひっくり返せば3'-----5'となるわけでハイブリダイズされるのでは…？

それでは塩基配列が逆ならびになるだけで、相補鎖にはなりません。
つまりsenseがantisenseになるようなものではありません。
そうやってひっくり返してもsenseはsense、antisenseはantisenseです。

DNA polにしてもRNA polにしても合成方向は5'->3'ですね。
いま二本鎖DNA
5'-AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC-3'
3'-tcagtcagtcagtcagtcagtcagtcagtcagtcag-5'

から酵素でRNAを合成したとしましょう。
プロモータが左側にあり右向きに合成する場合は
5'-AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC-3'（5'->3'方向）の鎖が
3'-tcagtcagtcagtcagtcagtcagtcagtcagtcag-5'（3'-5'方向）の鎖を鋳型にして合成されます。

逆にプロモータが右側にあり左向きに転写されれば
3'-tcagtcagtcagtcagtcagtcagtcagtcagtcag-5'の鎖が（ただし合成の向きは3'<-5'）
5'-AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC-3'の鎖を鋳型にして合成されます。

ですから、

＞でも逆にインサートの3'側を制限酵素処理してリニアライズ，インサートの5'側から合成したってハイブリダイズするんじゃないかと思ってしまいます。

反対側から合成された鎖の配列は、互いに相補ですが、同じ配列にはなりません。

＞DNAから転写されるRNAは2本鎖DNAの一方だけですが、2本鎖のどちらを選んで転写しているのでしょうか？(なんか決まった法則とかあるのでしょうか？)

転写プロモータに極性があるので、ひとつのプロモータからは一方向にしか転写されません。

この回答への補足

すぐのご回答、ありがとうございます。
お陰さまで、だんだん分かってきました！(塩基配列を紙に書きながら考えてました)。
つまり、
5'-------------3'
3'-------------5'
のDNAがあってプロモーターが左側にある時、
RNAは3'-----------5'を鋳型にして合成されるのですね。
だから、実際にできるRNAは5'------------AAAAA3'ですよね？
ですから、anti sense probeは5'------------3'を鋳型にして
5'側でリニアライズし、3'側から合成した3'AAAAA------------5'を用いる、と。
するとRNAとこのprobeの配列は相補的だからハイブリする。
このDNAで、
もしsense probeを作るとすれば、
3'------------5'を鋳型にして合成してるのでしょうか？
だから実際にできるsense probeは5'----------AAAAA3'
だから、RNAとハイブリしない、と。
これで、私はちゃんと理解できてますでしょうか？

補足日時：2007/01/07 21:14

No.3 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2007/01/08 00:14

＞もしsense probeを作るとすれば、

3'------------5'を鋳型にして合成してるのでしょうか？

そうなりますね。どちらの鎖が鋳型になるかはプロモータの向きによります。
in vitro transcriptionでRNAを合成するベクターはT3, T7, SP6などのプロモーターのうち2つがクローニングサイトをはさんで向かい合わせになっているので、どちらの鎖を鋳型にしたRNAも合成できるようになっています。

>これで、私はちゃんと理解できてますでしょうか？

おおむね良いとおもいます。
ただ、in vitro transcriptionで合成したRNAにはpoly-Aは付きませんけれど。

この回答へのお礼

Poly-Aは、付かないんですね。分かりました。
でも、お陰様で大変スッキリしました。長年の胸のつかえが取れて、疑問氷解という感じです。
これでやっと安心して実験できます。
私の疑問に、ご丁寧にお付き合い下さってどうもありがとうございました！！！大変感謝しております。

お礼日時：2007/01/08 13:49