ちょっと変わったマニアな作品が集結

食品工場で細菌検査業務を担当するものです。

現在ルーチンワークで製品中の一般生菌数、大腸菌群数、黄色ブドウ球菌、E.coli、サルモネラ菌 を検査していますが、現在、菌数のカウントのために常に誰かが休日出勤している状況です。
労働環境改善と人件コスト削減目的もあり、カウントの為の休日出勤をやめたいのですが、例えばインキュベーターのプログラム運転で指定培養時間(仮に24時間±2時間とします)を経過した時点より庫内温度を下げ、2時間以内に-10℃まで持っていけたら、その後コロニー数は増えない(=カウントに支障はない)のでしょうか?

具体的には、
 土曜日の15時に36℃で培養を開始し、
→翌日曜の15時から冷凍運転を始め、17時に-10℃に達した培地を
→翌月曜の8時にコロニー数をカウントする(培養開始より41時間、冷却開始より17時間経過)

といった感じです。

低温でも増殖する細菌がいるとは聞きますが、1、2日では肉眼で観察できるほどのコロニーにはならないのではないかと期待しました。(欲を言えばインキュベーター2台使って土日カウント止めたいぐらいです…きっと2台は買ってもらえないでしょうが…)

時間外労働は減らさねばならず、かといって出荷判定も早くしたいとなると、こんな方法しか思いつかないのですが…。

この方法は妥当なのでしょうか?
ちなみに培地は3M社のペトリフィルム(AC、EC、STX等)、DHL寒天培地、デソキシコレート寒天培地等を使用しています。

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A 回答 (4件)

 生物系の人間です。


 カウントには支障はないと思います。

 好気細菌のプレートカウントなら-10℃どころか4度まで落とせば状態を一週間近く保持できるというのが一般的です。4℃で菌の増殖速度は著しく落ちます。
 大腸菌は4度ならほぼ増殖はしないものと見てもいいでしょう。サルモネラ菌と黄色ブドウ球菌は低温で生える菌ですがその増殖可能温度は4度より2,3度高く、しかもラグタイム(菌が低温に慣れて増殖が始まるまでのスタートダッシュみたいなもの)が2,3日延びます(一週間くらいかも。数日レベルとおもっておいてください)。4度でも十分だと思います。まあ確実性を取りたいなら-10度の方が安心ではあるでしょうけど。

 また菌の中の水分が凍る温度では菌は増えませんので、-10度なら絶対に菌は増えません。プレートでは表に出ているコロニーは凍るはずですから。
 凍らせた後でもプレートカウントが出来るようなら-10度が一番いいですね。菌は死にますけど。(食品の検査ということですし、カウントした後その菌をどうこうしたり、凍らせて溶かした後に再度培養したりはしませんよね? それなら凍らせようがUV灯で殺菌しようがコロニーさえ残っていればいいはずです)
 凍らせた事が無いのでわからないのですがプレートが痛んで割れてしまったり、常温に戻すときに水が溜まったりしてしまうことに注意すればいけると思います。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
菌ごとの増殖の挙動の解説、大変参考になりました!サルモネラ、黄ブでも数日はいけるんですね。(とはいえ、もちろん大型連休などは真面目にカウントに来ますが)
UV灯で殺菌・・・思いつきませんでした・・。インキュベーター買い足し計画却下されたら試してみようかしら・・・。確かに仰る通りそこから釣菌とか同定とかしないので菌は死んでいても構いません。むしろ死んでいてくれたほうがそれ以上コロニー増えないし。UV灯って、タイマーでオンすることってできますよね?殺菌効果はどれくらいあるのでしょうか。滅菌までは望めないですよね・・・。でもちょっと検討してみようと思います!

お礼日時:2009/03/12 23:22

他の方が述べている通り、冷凍までする必要はないです。


かえって凍結することによる弊害が多いと思います。
多くの細菌は10℃以下になれば、発育しないか、発育速度が大きく低下します。
設定温度は4℃で良いでしょう。

但し、コロニーの形態、呈色反応を見るような試験では、冷蔵にする影響が全くないとは言えません。
それについては、やはり自主的に確認を行うことを推奨します。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
やはり冷凍は不要という意見が多いようですね。
冷凍と冷蔵についても比較試験してみようと思います。
また、冷凍や冷蔵のコロニー性状への影響も調べてみたいと思います。

お礼日時:2009/03/13 00:10

参考までに、



いつも実験で大腸菌を取り扱っています。
LBプレートにまいた大腸菌を一晩37℃で培養しコロニーを形成させたものは4℃の冷蔵庫で保存することがあります。

この場合、一ヶ月たってもコロニーは増えませんし、大きさも変化ありません。

あとの菌とか知りません。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
常に大腸菌を扱っていらっしゃる方の回答ということでとても興味深いです。
4℃だと1ヶ月経っても変化なしなんですね!保存ということは菌はフレッシュなまま生きているってことですよね。増えず、死なず、休眠状態・・・。
皆さんが冷凍の弊害を心配されている理由もその辺にあるのでしょうね。

お礼日時:2009/03/12 23:57

冷凍までしてしまうと、凍結による菌や培地に対する影響が出てしまう可能性があるように思います。

菌の増殖を抑えるという意味では冷蔵状態でも十分かも知れません。ただ、いずれにしても、確立した方法でなければ、社内で十分な検討とバリデーションが必要だと思います。

ちなみに、培養時間の幅はないのでしょうか? 出荷の判定が休み明けの朝で良いのであれば、培養時間の幅に入るように、試験の開始時間をずらすという手もあると思います。

それと、食品業界のことはよくわかりませんが、この試験は出荷前に行われているのでしょうか? 出荷後の確認であれば、逆に休み明けまで判定を遅らせることが問題になるような気がします。

詳しい状況がわからないので、不適切な指摘もあるかも知れませんが、何かご参考になれば幸いです。

この回答への補足

培養時間の幅は一番タイトなもので24時間±2時間です。ですから仮に月曜日の朝8時のカウントに合わせると日曜日(休日)の6時から10時の間に試験を行うことになり、休日出勤を減らすという目的から外れてしまうのです・・・。

あと、判定を待ってからの出荷となります(賞味期限の長い製品ですので)。週末の検査業務をストップして週明けに数日分の試験を行うという方法もあるとは思うのですが、そうすると本来2日あれば出せる出荷判定に最大6日掛かってしまい(連休の場合)、その間判定待ちの状態で在庫することになってしまいます。それが嫌で休日も検査(培養)を止められない・・・。でも出荷は平日なので、休日にカウントして出荷OKとなっても実際に出荷されるのは休日明けなのです。

補足日時:2009/03/12 21:48
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この回答へのお礼

早速の回答ありがとうございます。
そうですね、充分な検討が必要ですよね。
まずは現状の方法と並行してこのやり方で試験して、比較したデータを集めてみようと思います。それでうまくいけば文書化=ルール化できると思いました。

お礼日時:2009/03/12 22:43

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Aベストアンサー

用途次第でしょうが
僕の経験上、3ヶ月前のアンピシリン添加のLB寒天培地でも
大腸菌の形質転換後の選択には使用可能でした。

性能が落ちる原因は、
有効成分の劣化(分解)という意味とほぼ同じだと思われるので
抗生物質、色素、ビタミンなど分解しやすいものの含有量や
用途の精度次第で変わってきます。
通常は長くて1ヶ月、特殊なプレートは1週間が目安でしょうね。

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よろしくお願いいたします。

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バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

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>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
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>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

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ストラテジーはま、方法みたいなもんです。制限酵素認識部位を見逃してないかとか、ちょっとした見落として理論的には不可能なことをしていないかということです。

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Aベストアンサー

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
-70℃ディープフリーザーで保存しておき、必要時には、それを直接LB培地に
入れて培養する、という方法で基本的には問題なかったです。

プラスミドが抜け落ちると、よく言われますが実際にそういう現象にあたったことは
1回しかありませんでした。

寒天培地で保存は4℃の冷蔵庫で倒置して保存ということになりますが、これは
賞味期限?が短いです。1週間くらいが限度と思ってください。時間がたてばたつぼど
増殖が明らかに悪くなります。継代するなら3日とかくらいの頻度で移し替えて
いかないとだめかな、という印象です。あと、寒天培地をつくったときにまだ温度が
高い状態でシャーレに培地を入れて固めたときには、冷蔵庫で冷やしたときに
水滴がでてびしょびしょになることがあるので、注意してください。

いずれにせよ、

(1)精製したプラスミドは-30℃で保存する
(2)プラスミドを増やす用に形質転換した大腸菌株のストック(たとえばDH5αにプラスミドが
 入っているもの)も上と同じように、グリセロールストックで-70℃保存しておく。
(3)形質転換した発現用大腸菌もグリセロールストックで-70℃保存しておく。

とかしておくと、実験が早く進むと思います。

最も基本的なプロトコルは、精製した発現ベクターを適切な濃度で-30℃で保存しておき、
必要に応じて、大腸菌(大量に培養されるということなのでたぶんBL21(DE3)株とかかな
と推定します)を形質転換する、と書かれているとは思います。

ただ、実際にやった経験からいうと、
発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB(amp)液体培地で培養し、OD660nmが
0.5から0.6くらいになったもの3に対して、80%グリセロール溶液1を混ぜたもの
(最終グリセロール濃度が25%程度)を1mLずつエッペンドルフチューブに分注して
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Q細菌の寒天培養

高校の科学部で、身近な細菌を調べることになりました。

寒天培地で培養してできるコロニーから判定する際の参考に、代表的な細菌のコロニーの特徴を記した、資料(写真)などが載ったサイトを探していますが、意外と見つかりません。
(培地の作り方や、培養方法などはみつかるのですが)

どなたか、ご存知でしたら教えて下さい。

食中毒を起こすような細菌の資料があるとうれしいです。
一応、嫌気性細菌を培養するための設備もあります。

Aベストアンサー

こんにちは。
生物系の学生で、同じような実験の経験があります。
コロニー形状だけから細菌の種類を同定するのは難しいでしょう。
お望みのような資料が少ないのもそのせいだと思います。
他にもグラム染色や顕微鏡観察などで、より詳しく調べる予定なのでしょうか?

また、使う培地の種類によっても、生えてくる菌は違います。
特定のタイプの細菌を得たいなら、その細菌がよく生えるような培地を、
単に色々な種類の細菌を見てみたいということなら標準培地を使います。

コロニーの分類には、コロニーの形、色、透明度、大きさ、隆起、表面がなめらかかどうか、
コロニーのふちがギザギザかスムースか、硬いか柔らかいかなどを見てみるといいと思います。

一応、多少の参考になるかな?と思ったURLをいくつかご紹介しておきますね。
ご自分でも、「食品 検査 細菌」、「コロニー 形状」などのキーワードで
検索してみると、参考になるものが見つかるかもしれませんが、
基本的には私も#1さんと同様、大きめの図書館などで
微生物学系の本を見たほうが正確ですし、近道だと思います。
「微生物の分類と同定」(学会出版センター)などがおすすめです。

■細菌汚染検査
コロニーの観察項目と分類について図つきで説明があります。
下のほうにコロニーから汚染を判断する基準についての表もあるのですが、
それぞれ使っている培地が異なるので、あまり役に立たないかな。
http://www.setsunan.ac.jp/pharm/ftphome/homepage/bisei/1500TXT.html

■細菌検査装置「アルゴス」のQ&Aページ
1. 基礎知識 の部分が役に立つのではと思います。
http://www.arttec-net.com/argos/answer.htm

■ 食品検査における細菌培養について
http://www.jarmam.gr.jp/situmon/shokuhin_kensa.html

こんにちは。
生物系の学生で、同じような実験の経験があります。
コロニー形状だけから細菌の種類を同定するのは難しいでしょう。
お望みのような資料が少ないのもそのせいだと思います。
他にもグラム染色や顕微鏡観察などで、より詳しく調べる予定なのでしょうか?

また、使う培地の種類によっても、生えてくる菌は違います。
特定のタイプの細菌を得たいなら、その細菌がよく生えるような培地を、
単に色々な種類の細菌を見てみたいということなら標準培地を使います。

コロニーの分類には、コロ...続きを読む

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む


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