とある病理組織をパラフィン包埋した後、ミクロトームで切片を切ろうとしたのですが、きれいに切れません。パラフィンのところはきれいに切れたのですが、組織のところでボロボロになってしまいます。ミクロトームの刃を代えてもだめで、いろいろ条件を変えてみてもだめでした。包埋しなおした方がいいのでしょうか?何か解決策があれば教えてください。ちなみに厚みは4μです。

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A 回答 (2件)

まず、切る時ですが、経験的にパラフィンブロックは少し暖かいほうが切りやすいです。

冷たいままだとうまくいきません。
私は、夏はいいですが、冬には37℃のインキュベーターに数分いれて温めてから切り始めます。
少し暖かい環境のほうが切りやすいです。剃刀の歯とかもしかりです。

次に、包埋時ですが、透徹に使う有機溶剤(キシレンなど)にはあまり長くつけすぎると組織が硬くなって切りづらい場合があります。
また、パラフィンにつけておく時間を24時間とか長くすることで、切りやすくなた組織もありました。

あとは、少し厚い切片から切る練習をしてみるとかでしょうか。

思いつくままに、参考まで。
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質問者様のブロックは、他の人が切った場合どうなのでしょうか?



切れない理由として考えられるのは多岐にわたります。

ブロック作成の問題(有機溶媒の浸透、パラフィンの浸透などなど)
切り方の問題(ブロックの温度、熟練度など)
などなど。

質問者様が試されたという条件もわからないので、あまりに的が絞れません。

この回答への補足

何人かの人にやってもらったのですが、うまくいきません。
乳腺組織を切っているのですが、脂肪が多くパラフィンの浸透がうまくいっていないのだと一応考えています。
ブロックは冷蔵した後に切っているので、比較的低温度だと思います。
何かいい解決策はないでしょうか?

補足日時:2009/05/20 16:16
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Qパラフィン切片について

こんにちは、いつもお世話になってます(^_^)

皮下組織を含む皮膚組織を包埋した
パラフィンブロックを薄切して
3μm厚のパラフィン切片を作製しています。

薄切するところまではいいのですが…、
悩みは次の二つです。
(1)伸展版にスライドグラスを置いて
 30分くらい経って切片を見てみると
 組織のなかに(スライドグラスと切片の間に)
 泡ぶくというか水泡のような盛りあがり
 ができている。

(2)脂肪組織を多く含む大きめの切片は
 伸展版にのせておくと花開くように
 分解して組織がくずれてしまう。

原形を保ったままきちんとスライドグラスに
貼り付けたいです…。
改善できるよい方法をお知りの方、ご教授願います。
ちなみに、
使っているスライドグラスはアルブミンスライドです。
伸展版にのせたあとは十分に水分をろ紙で除いています。
伸展版の温度は45~48度の設定です。
油分が残らないように手はしっかり洗ってから行っています。

Aベストアンサー

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があります。
私の場合は、伸展台にキムタオル(薄い1枚にした物)を伸展台の上に敷き、切片をスライドグラスに載せた後、スライドグラスを傾けて、なかなか切片の下の水分が切れない場合は、切片の角を少し破って、そこに濾紙を当てて吸い出してました。こうすると、水泡のような物が出にくくなります。

さらに、薄切して切片をスライドグラスに取る前に、水ではなくお湯を使われていますか?この場合、お湯が高いと、当然脂肪組織は解離しやすくなりますので、温度には注意する必要があります。人肌より少し温かい位が適温です。水よりもお湯の方が伸びが良いので、お湯を使うこと自体は悪くないと思います。
さらに、私は脳組織を主に薄切していたのですが、その際には、1%酢酸水を温めたものに切片を浮かせて伸ばし、スライドグラスにすくってました。こうすると、きれいにしわもなく伸び、他の組織切片を作製する際も、多少臭いですが、きれいに仕上がるのでこの方法で行ってました。

一度お試しあれ…。

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があり...続きを読む

Q組織の固定処理から包埋に移る際に

パラフィン処理をすると思うんですが、流動パラフィン(和光社製)
で行えばよろしいのでしょうか?

はじめて組織切片をつくるため色々な本を参考にしてはいるのですが、
パラフィンのことは特に何も書いていないので良くわからないので質問させていただきました。

回答宜しくお願いします。

なおプロトコルは東京大学ラボマニュアルー核内情報研究分野を参考にしています。

Aベストアンサー

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58-60℃の融点のものでしょう。

5mm角以下の組織であれば、70,80,90,95,100%エタノールを1-3時間ずつ室温で浸漬していきます。組織によっては浸透しにくいものもありますので、これは経験になりますが、極端に長くならなければ大丈夫ですので、不安なら多めに浸漬すると良いでしょう。100%エタノールは3回ほど通し、完全に水分を除去します。その後キシレンを1-1.5時間、計3回移し、60℃のパラフィンに浸漬します。キシレンとパラフィンの間にXyl:para=1:1に浸漬するとパラフィンが浸透しにくい組織に有効です。この時に流動パラフィンを使うこともできますが、Xyl/paraで十分です(しなくても良いです)。60℃のまま、恒温器の中で30-60分ずつ計3回ビーカーの組織を移していきます。
包埋する際には、予め温めた包埋皿(ステンレス製のものがありますが、アルミホイルで型を作った方が安い)に60℃のパラフィンを注ぎ、組織を沈めます(切る方向が底面からになりますので方向性を確認して)。軍手をしないと熱いです。ピンセットはアルコールランプやガスバーナーで熱しながら組織を扱います。ホットプレート(低温60℃程度にできるもの)があると余裕ができるので楽です。自然に室温に放置しておけば固まります。台木などに熱したスパーテルで貼り付けてミクロトームで切ります。

とにかく、周辺がパラフィンで汚れますので、器具はパラフィン専用とし、実験台にも新聞紙を敷きましょう。もし汚れたらキシレンを浸み込ませたペーパータオルで拭きます(臭いので換気して)。

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58...続きを読む

Q染色についての疑問なのですが、誰か教えて下さい。

病理学実習で行った最も有名で、1番popularなHE染色についてなのですが…
(1)今回実習で行ったのは、カラッチのヘマトキシリンだったのですが、他には、どんな種類が存在しますか?
(2)カラッチのヘマトキシリンを作ったときに、いろいろな物を加えました。それで、ナノですが、ヘマトキシリン液についての原理を知れば、入れた物質の役割が分かるのではないかと考えました。そこで、質問です!!ヘマトキシリン液の原理って、何ですか?
(3)染色には、退行性と進行性があり、退行性の染色液には、”分別”と言う操作が、必要って、文献に書いてあったのですが…分別には、どんな種類の薬品を使うのですか? 実習では、0.25%塩酸を用いました。
(4)試薬が、良ければ、色出しの操作は、不要みたいなのですが、色出しって、何なのですか?色出しには、どんな試薬が、使われているのですか?

だれでも良いので、こんな馬鹿な私に教えて下さい。

Aベストアンサー

実習の時に質問すりゃぁいいのに…ま、病理医にはわからんか。

私の場合普段はマイヤーの処方を薄い切片用にアレンジした「ダブ
ルマイヤー」を常用していますが、必要ならカラッチやギルも調整
します。ハリスは水銀を使うからパス。ワイゲルトの鉄ヘマトキシ
レンはHE染色用ではありません。

処方の基本は、「色素」+「酸化剤」+「媒染剤」です。酸化剤には
ヨウ素酸ナトリウムを常用します。これで無色のヘマトキシレンが
ヘマティン色素になります。媒染剤は金属イオンを添加して色ラッ
クを形成させ組織との結合を強くするもので、ミョウバンを使うと
青紫になります。ここで鉄を使うと茶褐色っぽい色になりますね。
最後に安定剤として抱水クロラールやグリセリンを混ぜて完了。色
ラックが正に帯電しているため、負に帯電するリン酸基やカルボキ
シル基と結合しやすいわけです。

分別ですが、上記の理屈で染まるからにはpHの影響ってモノを受け
るわけで、pHが4くらいだと結構なにもかも染まってくるんです。こ
れを、染めた後で塩酸アルコールなどでpHを下げて、リン酸基のと
ころだけ残してカルボキシル基のところを脱色してやるのが「分
別」という作業です。全体を染めてから要らないところを抜くから
「退行性染色」。逆に最初っから酸を加えてpH2とかの染色液を作
り、リン酸基リッチのところしか染まらないようにしたのが「進行
性染色」。カラッチが退行性染色の代表で、マイヤーが進行性染色
の代表です。

色出しってのは、ヘマトキシレンで染色した後でしばらく流水で洗
うステップですが、これはpHを上げています。すると水素イオンが
色ラックに干渉し難くなり、赤褐色から安定した青紫色になって、
褪色もしなくなります。

以上、藍染めと全く同じだよっていう話でした。

実習の時に質問すりゃぁいいのに…ま、病理医にはわからんか。

私の場合普段はマイヤーの処方を薄い切片用にアレンジした「ダブ
ルマイヤー」を常用していますが、必要ならカラッチやギルも調整
します。ハリスは水銀を使うからパス。ワイゲルトの鉄ヘマトキシ
レンはHE染色用ではありません。

処方の基本は、「色素」+「酸化剤」+「媒染剤」です。酸化剤には
ヨウ素酸ナトリウムを常用します。これで無色のヘマトキシレンが
ヘマティン色素になります。媒染剤は金属イオンを添加して色ラッ
クを形成さ...続きを読む

Qパラフィンブロックの切片

いまさら、で、かつこんなところで聞くのもすみません、という感じなんですが、本当に困っております。どうかどなたかお教えください。

パラフィンブロックをマイクロトームで5ないし7umで(脳切片)切り落としているんですが、最近だんだん切片がしろくなるようになりました。以前はあたたかいお湯の上に(何度だったかわかりません、waterbathをメモリで覚えていたのが問題でした)のせてスライドですくってそのままお湯を切るためにしばらく立てかけておいてあとは37度で一晩おいていました。それでおおむね良かったのですが、それも時々は白くなっていました。
最近久しぶりに切り始めたのですが50度の湯浴にうかべて(これがあついのかすぐに割れ始めたりパラフィンがこなごなにきたなく分離するので40度くらいのお湯にかえてみて、サンプルはよくのびて溶けすぎるのはなくなりました)、そのあとすくって放置するのですがすぐに白ーく粉吹き団子のようなしろい切片になるのです。56度のホットプレートでもう一度とかしたりしているのですがそのあとひやすとやっぱり白いようです。いったいどういう条件が切片を白くさせるのかわかりません。どなたかご教示ください。
 また、ブロックを切るときに切片が二つ三つと別れて、ときにはたこの足かシュレッダーかさえ思うような感じに切れてしまいます。どうやってこれを回避すればいいのかわかりません。余分なパラフィン部を削ったり、冷やしたり(これでいいこともありますが脳は冷やさない方がいいとも言われた事もあります)、息を吹きかけたり(これも結構いいときもあります)、と言われた事はやっているのですが、ブロックの四角い面が全部おおむねつながって切り落とされる事がありません。つながってさえいれば、しわしわでもくるくるでも問題ないのですがいつもばらばらなので最近閉口しています。どなたかご教示を。
 最後に、静電気がひどくてたこ足切片をピンセットではじをつかもうならあっというまに切片がひっくり返ってまとわりつきこれも困ってます。静電気についてご存知の方、なにかお知恵を。

いまさら、で、かつこんなところで聞くのもすみません、という感じなんですが、本当に困っております。どうかどなたかお教えください。

パラフィンブロックをマイクロトームで5ないし7umで(脳切片)切り落としているんですが、最近だんだん切片がしろくなるようになりました。以前はあたたかいお湯の上に(何度だったかわかりません、waterbathをメモリで覚えていたのが問題でした)のせてスライドですくってそのままお湯を切るためにしばらく立てかけておいてあとは37度で一晩おいていました。それでおおむ...続きを読む

Aベストアンサー

切片中の組織のところが白くなるということは、私も経験あります。
しかし、前回の回答のとおり、
切り方が悪いか、固定や包埋時における組織の状態が原因であることが多いです。
特に、包埋時に組織にパラフィンが十分浸透していないとなりやすい気がします。
大きい組織の時にはパラフィンにつけておく時間を注意する必要があるように思います。

また、仮に白くなったとして、その切片を脱パラ→加水するとどうなるのでしょうか?
私もたまに乾燥させると白くなる組織に出会いますが、加水して組織を見ると問題なく、また免疫染色等も問題ないこともあります。

Q動物組織切片作成のパラフィン包埋について

動物の組織切片標本を作ろうと思っています.自動包埋機がなく,パラフィン包埋(エタノールで脱水→キシレン→パラフィン)を1日でやるのはすこしきびしいので,どこかの工程で一夜置いておこうと思うのですが,どこが一番よいでしょうか?また,ここであまり長く置くとよくない,というところがありますか?

よろしくお願いします.

Aベストアンサー

最初に70%程度の低濃度アルコールで一晩置くと、後の処理がスムーズで、なおかつ組織の収縮も少ないです。アルコール濃度が高くなると、その分組織の収縮もきつくなります。ですが、あまり組織片が小さすぎると、かえって収縮がきつく起こる可能性もありますので、ゆっくりと時間を掛ける場合は、気をつけた方が良いでしょう。

パラフィン層で長時間置くのは避けるべきです。熱が掛かっている分、やはり組織へのダメージは強くなるわけですから。キシレンまで済んでしまえば、浸透器があるのでしたら、そこで1時間ずつ3層パラフィンを置けばいいでしょう。

組織標本の作製は、どの組織をターゲットとするかでも違ってきます。脂質の多い脳などでは、アルコール処理を長めにして、十分に脱脂効果を狙って包埋していく工程を取ったりします。

Q組織学・包埋方法について

組織染色をしています.今はパラフィン包埋で行っていますが,組織の問題なのか,固定の問題なのか,薄切がうまくできません(カスカスしてしまっています).
パラフィンの浸透が悪いのかと思ってパラフィンの時間を変えてみましたが全く改善しなかったので,これが問題ではないと思います.
包埋方法を変えるにも,セロイジン包埋は時間がかかりすぎて実用的ではないし,うまく薄切できる,何か良い方法はないでしょうか.
こんなKitも考えてみたのですが..
http://www.funakoshi.co.jp/h_news/0308/030804_POLm.php
よろしくお願いいたします.

Aベストアンサー

筋組織でしたら、カスカスすることはあると思います。
筋組織はご存知と思いますが「線維」状ですので
線維にそって縦にきれいに切出されていれば 比較的薄切しやすいですが
横や斜めに切出しすると、線維が断ちきられて ボソボソして薄切しにくいです
ですから まずは切出しを気を付けることなのですが 
筋組織はやはり縦切り 横切り両方を観たいものですよね

操作としては 硬化しやすいですから 固定から包埋まで
(脱水・脱アルコール)あまり時間をかけすぎてはいけません
パラフィンは充分に浸透させるのがいいのですが
熱がかかることなどでこちらも硬化しますから 
やはりパラフィン浸透時に陰圧をかけるのがいいでしょう
自動包埋装置でしたら 陰圧はかかってるはずです
パラフィンも硬・軟合わせてやや軟らかめのほうがいいと思います

染色は「通常」と言うことはHE染色でしょうか?
筋組織でしたら他にEVGや免疫染色が入るかと思いますが
その場合 薄切標本がはがれやすいので 
はがれにくいように スライドグラスをコーティーングしたものが
市販されてますので それがお勧めです
きれいな標本ができるといいですね
がんばってください

筋組織でしたら、カスカスすることはあると思います。
筋組織はご存知と思いますが「線維」状ですので
線維にそって縦にきれいに切出されていれば 比較的薄切しやすいですが
横や斜めに切出しすると、線維が断ちきられて ボソボソして薄切しにくいです
ですから まずは切出しを気を付けることなのですが 
筋組織はやはり縦切り 横切り両方を観たいものですよね

操作としては 硬化しやすいですから 固定から包埋まで
(脱水・脱アルコール)あまり時間をかけすぎてはいけません
パラフィンは充分...続きを読む

Q包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。

包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。
今までは、パラフィン包埋をするのに陶器?の包埋皿にグリセリンを塗って使用していたのですが、今回包埋カセットを利用できるようにティシューテックのステンレスの包埋皿を購入しました。
しかし、この包埋皿からうまくブロックを取り出すことができません。ブロックの取り出しのコツをご教授いただければと思い質問させていただきました。
初歩的なことで申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

> 周辺温度を-5℃程度に
> できれば特別なことをしなくても外れる

と思いますよ。大昔、台木から外して包埋し直すときに、冷凍庫に
入れとくだけでみんなとれちゃいましたから。

大量に薄切してみれば、急速に均一に冷却されたパラフィンの切り
やすさは実感出来るはずです。翌週もう1ダース追加で薄切するは
めになれば、ティシューテックに感謝することになります。この道
四半世紀になりますが、スライドグラスを特注するような大型標本
でない限り、ティシューテックを使わないって選択肢は勘弁してほ
しいですね。

QImageJを用いて免疫染色陽性率の計算の仕方

Ki67の免疫染色の陽性率を、このソフトを用いて解析ができるという話を聞いたのですが、まったく使いたかが分かりません。
ヘマトキシリンの青の部分と、免疫染色の茶の部分をわければ解析ができるのでしょうか?
どうか使用方法を教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

色を分離しなくても Cell Counter プラグインを使えば数えられますが、手作業なので少し時間はかかりそうです。

imageJで細胞数等を数えるCell Counter|LifeScienceProject
http://life-science-project.com/1005/


染色されている部分と背景がくっきり分かれている画像であれば、もう少し楽なやり方ができます。
まずヘマトキシリンと免疫染色(DAB?)を分離するために Colour Deconvolution プラグインを使います。

Colour Deconvolution
http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/cdeconv/cdeconv.html

プラグインのインストールは、上記のページの "java and class fils" をダウンロードして解凍し、ImageJ フォルダの中の plugins フォルダに入れて ImageJ を起動させれば良いはずです。
ImageJ で解析したい画像を開いて Plugins メニューから Colour Deconvolution を選択し、Vectors で "H DAB" を選んで OK を押します。
このプラグインで色を分けた後、ヘマトキシリンと免疫染色(DAB?)の画像を Analyze Particles で解析して染色された核の数をカウントすれば OK です。

ImageJの日本語訳~Analyze~
http://www.hm6.aitai.ne.jp/~maxcat/imageJ/menus/analyze.html#AP

色を分離しなくても Cell Counter プラグインを使えば数えられますが、手作業なので少し時間はかかりそうです。

imageJで細胞数等を数えるCell Counter|LifeScienceProject
http://life-science-project.com/1005/


染色されている部分と背景がくっきり分かれている画像であれば、もう少し楽なやり方ができます。
まずヘマトキシリンと免疫染色(DAB?)を分離するために Colour Deconvolution プラグインを使います。

Colour Deconvolution
http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/cdeconv/cdecon...続きを読む

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

Q「該当」と「当該」の違い

辞書には、「該当」・・・その条件にあてはまること。「当該」・・・その事に関係がある。
・・・とあります。
“あてはまる”と“関係がある”、微妙に違うようで似ているようで、お恥かしいのですが私にははっきり区別ができないのです。
該当とすべきところを当該としたら、意味はまったく違ってくるでしょうか?
わかりやすく両者の違いや使い方を解説していただけませんか?宜しくお願いします。

Aベストアンサー

よく似た意味の言葉(名詞)ですが、

○該当…「する」をつけて「当てはまる」という意味の動詞として用いることができる

○当該…主に他の名詞の前につけて「今議論の対象になっている、まさにそのもの」という意味で内容を限定する形容詞的な形で用いる

といった違いがあります。逆の用法はありません。

・この条件に当該する人は申し出てください。

・○○事件につき、該当被告人を有罪に処す。

いずれもおかしな使い方で、反対でないとアウトです。

ご参考になれば幸いです。


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