とある病理組織をパラフィン包埋した後、ミクロトームで切片を切ろうとしたのですが、きれいに切れません。パラフィンのところはきれいに切れたのですが、組織のところでボロボロになってしまいます。ミクロトームの刃を代えてもだめで、いろいろ条件を変えてみてもだめでした。包埋しなおした方がいいのでしょうか?何か解決策があれば教えてください。ちなみに厚みは4μです。

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A 回答 (2件)

まず、切る時ですが、経験的にパラフィンブロックは少し暖かいほうが切りやすいです。

冷たいままだとうまくいきません。
私は、夏はいいですが、冬には37℃のインキュベーターに数分いれて温めてから切り始めます。
少し暖かい環境のほうが切りやすいです。剃刀の歯とかもしかりです。

次に、包埋時ですが、透徹に使う有機溶剤(キシレンなど)にはあまり長くつけすぎると組織が硬くなって切りづらい場合があります。
また、パラフィンにつけておく時間を24時間とか長くすることで、切りやすくなた組織もありました。

あとは、少し厚い切片から切る練習をしてみるとかでしょうか。

思いつくままに、参考まで。
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質問者様のブロックは、他の人が切った場合どうなのでしょうか?



切れない理由として考えられるのは多岐にわたります。

ブロック作成の問題(有機溶媒の浸透、パラフィンの浸透などなど)
切り方の問題(ブロックの温度、熟練度など)
などなど。

質問者様が試されたという条件もわからないので、あまりに的が絞れません。

この回答への補足

何人かの人にやってもらったのですが、うまくいきません。
乳腺組織を切っているのですが、脂肪が多くパラフィンの浸透がうまくいっていないのだと一応考えています。
ブロックは冷蔵した後に切っているので、比較的低温度だと思います。
何かいい解決策はないでしょうか?

補足日時:2009/05/20 16:16
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よろしくお願いします.

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パラフィン層で長時間置くのは避けるべきです。熱が掛かっている分、やはり組織へのダメージは強くなるわけですから。キシレンまで済んでしまえば、浸透器があるのでしたら、そこで1時間ずつ3層パラフィンを置けばいいでしょう。

組織標本の作製は、どの組織をターゲットとするかでも違ってきます。脂質の多い脳などでは、アルコール処理を長めにして、十分に脱脂効果を狙って包埋していく工程を取ったりします。

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低いものは何かありませんでしょうか?
最初、パラフィンが良いと思ったのですが、試薬屋で売っているものでも
分子量が分布していて、融点がぼけているので、出来れば純粋な物質が
よいです。

P.S.
物理カテゴリーで似た質問(解けるに限定せず相転移を起こすもの)
を伺い、氷酢酸など、多くの面白い例を頂きました。化学カテゴリーで、
有機物に限定してお聞きしたいと思います。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

物理のほうの質問も拝見しました。氷酢酸は素手で触れれば薬傷を
起こしますし、オープンで扱うなら刺激臭が気になりそうですが、
お湯やヘアドライヤーの範囲に融点を持つ単一物質は多くあります。

オクタデカン(28-30℃)まさにパラフィン
ドデカノール(22-26℃)悪臭かも??
2-メチル-2-プロパノール(25-26℃)
1,2-オクタンジオール(36-38℃)ちょっと高価
パルミチン酸メチル(32-34℃)
アジピン酸モノエチル(28-29℃)ちょっと高価
コハク酸ジメチル(18-19℃)

「1Hを含むもの」の意図がわからないので、外しているかも
しれません。試薬カタログから拾っただけなので自信なし。
安全性についてはMSDSなどをご確認ください。

Q包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。

包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。
今までは、パラフィン包埋をするのに陶器?の包埋皿にグリセリンを塗って使用していたのですが、今回包埋カセットを利用できるようにティシューテックのステンレスの包埋皿を購入しました。
しかし、この包埋皿からうまくブロックを取り出すことができません。ブロックの取り出しのコツをご教授いただければと思い質問させていただきました。
初歩的なことで申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

> 周辺温度を-5℃程度に
> できれば特別なことをしなくても外れる

と思いますよ。大昔、台木から外して包埋し直すときに、冷凍庫に
入れとくだけでみんなとれちゃいましたから。

大量に薄切してみれば、急速に均一に冷却されたパラフィンの切り
やすさは実感出来るはずです。翌週もう1ダース追加で薄切するは
めになれば、ティシューテックに感謝することになります。この道
四半世紀になりますが、スライドグラスを特注するような大型標本
でない限り、ティシューテックを使わないって選択肢は勘弁してほ
しいですね。

Qキャンドル用のパラフィンワックス

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Aベストアンサー

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分子式がCnH2n+2で表されるもので、炭素数の違いや
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ここからは推定ですが....
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回答宜しくお願いします。

なおプロトコルは東京大学ラボマニュアルー核内情報研究分野を参考にしています。

Aベストアンサー

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58-60℃の融点のものでしょう。

5mm角以下の組織であれば、70,80,90,95,100%エタノールを1-3時間ずつ室温で浸漬していきます。組織によっては浸透しにくいものもありますので、これは経験になりますが、極端に長くならなければ大丈夫ですので、不安なら多めに浸漬すると良いでしょう。100%エタノールは3回ほど通し、完全に水分を除去します。その後キシレンを1-1.5時間、計3回移し、60℃のパラフィンに浸漬します。キシレンとパラフィンの間にXyl:para=1:1に浸漬するとパラフィンが浸透しにくい組織に有効です。この時に流動パラフィンを使うこともできますが、Xyl/paraで十分です(しなくても良いです)。60℃のまま、恒温器の中で30-60分ずつ計3回ビーカーの組織を移していきます。
包埋する際には、予め温めた包埋皿(ステンレス製のものがありますが、アルミホイルで型を作った方が安い)に60℃のパラフィンを注ぎ、組織を沈めます(切る方向が底面からになりますので方向性を確認して)。軍手をしないと熱いです。ピンセットはアルコールランプやガスバーナーで熱しながら組織を扱います。ホットプレート(低温60℃程度にできるもの)があると余裕ができるので楽です。自然に室温に放置しておけば固まります。台木などに熱したスパーテルで貼り付けてミクロトームで切ります。

とにかく、周辺がパラフィンで汚れますので、器具はパラフィン専用とし、実験台にも新聞紙を敷きましょう。もし汚れたらキシレンを浸み込ませたペーパータオルで拭きます(臭いので換気して)。

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58...続きを読む

Q融点についての質問です。

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できるだけ良質なゲノムDNAを抽出したいので、どなたかプロトコル、書籍・論文等の参考文献、経験上のアドバイス・注意点などを教えて頂けると助かります。
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Aベストアンサー

OCTコンパウンドに包埋してあるなら、コンパウンドが水溶性ですから、PBSなどで軽く洗うだけで大丈夫じゃないですか?ゲノムDNAの抽出ならRNAほど気を使わなくても、DNA精製中にコンパウンドは除去できると思いますよ。
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為に配合していますが、パラフィンを塩素化することで、
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イメージ的に塩素化パラフィンの方が加工性に優れているよう
に思えるのですが?そういうものなのでしょうか?

Aベストアンサー

塩素化パラフィンとパラフィンとでは、添加目的が異なるのではないでしょうか。

通常のパラフィンは、いわば固形燃料のようなもの(分子量が小さければ液体)
ですが、塩素化されたものは燃えにくくなるため、ゴムの難燃性を向上させる
目的で添加されているものと思います。
(但し、環境汚染の問題で、現在は別のもの(臭素系など)を使うことの方が多い
 のではないかと思うのですが・・・;
 「グリーン調達」などでは、使用禁止の対象にもなっていますし)
http://www.env.go.jp/chemi/anzen/lcms_method/2-5-3.pdf

*なお、この物質の添加により、実際に加工性も変化するとは思います。
 但し、それを「主目的」にしているわけではないのでは、という意味です。

Qパラフィン切片について

こんにちは、いつもお世話になってます(^_^)

皮下組織を含む皮膚組織を包埋した
パラフィンブロックを薄切して
3μm厚のパラフィン切片を作製しています。

薄切するところまではいいのですが…、
悩みは次の二つです。
(1)伸展版にスライドグラスを置いて
 30分くらい経って切片を見てみると
 組織のなかに(スライドグラスと切片の間に)
 泡ぶくというか水泡のような盛りあがり
 ができている。

(2)脂肪組織を多く含む大きめの切片は
 伸展版にのせておくと花開くように
 分解して組織がくずれてしまう。

原形を保ったままきちんとスライドグラスに
貼り付けたいです…。
改善できるよい方法をお知りの方、ご教授願います。
ちなみに、
使っているスライドグラスはアルブミンスライドです。
伸展版にのせたあとは十分に水分をろ紙で除いています。
伸展版の温度は45~48度の設定です。
油分が残らないように手はしっかり洗ってから行っています。

Aベストアンサー

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があります。
私の場合は、伸展台にキムタオル(薄い1枚にした物)を伸展台の上に敷き、切片をスライドグラスに載せた後、スライドグラスを傾けて、なかなか切片の下の水分が切れない場合は、切片の角を少し破って、そこに濾紙を当てて吸い出してました。こうすると、水泡のような物が出にくくなります。

さらに、薄切して切片をスライドグラスに取る前に、水ではなくお湯を使われていますか?この場合、お湯が高いと、当然脂肪組織は解離しやすくなりますので、温度には注意する必要があります。人肌より少し温かい位が適温です。水よりもお湯の方が伸びが良いので、お湯を使うこと自体は悪くないと思います。
さらに、私は脳組織を主に薄切していたのですが、その際には、1%酢酸水を温めたものに切片を浮かせて伸ばし、スライドグラスにすくってました。こうすると、きれいにしわもなく伸び、他の組織切片を作製する際も、多少臭いですが、きれいに仕上がるのでこの方法で行ってました。

一度お試しあれ…。

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があり...続きを読む


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