レポーターアッセイされた細胞は正常に働くのか？

レポーターアッセイについて疑問に思う点があります。

レポーターアッセイとは、目的遺伝子をレポーター遺伝子に置き換えることで、知りたい遺伝子がどこでどのくらい発現しているのかを調べることですが、このとき細胞は生きた状態なのですよね？

では、細胞の持つ一部の遺伝子がレポーター遺伝子に置き換えられてしまうことで、その細胞が正常な活動を行えなくなる、などということはないのでしょうか？
レポーターアッセイが原因で細胞が死んでしまうという可能性はないのですか？


回答よろしくお願いします！！

No.2 ベストアンサー 回答者： hiddenleaf 回答日時： 2013/03/19 13:42

ちょっと認識がずれている気がします。

「レポーターアッセイとは、目的遺伝子をレポーター遺伝子に置き換える」
「細胞の持つ一部の遺伝子がレポーター遺伝子に置き換えられてしまう」
これは大きな誤解ですので、今一度よく確認された方が良いかと思います。

一般的には転写因子の活性具合をみる試験です。
その転写因子が結合するプロモーターを持った、レポーター遺伝子を細胞に入れるわけです。
なので、転写因子によってはNo.1様の述べた毒性がでる可能性はなくもないです。
すぐに溶解して試験にかけるので、毒性があったところで関係ない気もしますが。
細胞増殖をみる試験ではないですからね。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
おっしゃるとおり、どうやら私が勘違いしていたようです。

私は目的遺伝子が全てレポーター遺伝子に置き換えられるものだと勘違いしていましたが、正しくは、レポーターアッセイを行う細胞には「その細胞が元々持っている目的遺伝子」と、「試験するために外部から入れたレポーター遺伝子」の2つが存在するということだったんですね。
そしてこのレポーター遺伝子には目的遺伝子と同一のプロモーターを持たせてあるので、本来は目的遺伝子のプロモーターに結合する転写因子がレポーター遺伝子に結合し、転写因子の活性具合がレポートされるということなのですね。

勘違いを的確に指摘していただき、ありがとうございました。
勉強になりました。
まだまだ勉強不足の部分があることも自覚しましたのでそのあたりもきちんと押さえておこうと思います。

お礼日時：2013/03/19 23:56

No.3 回答者： larme001 回答日時： 2013/03/20 11:20

#1の方がおっしゃっているようなレポーターが大過剰に存在することによって細胞内の本来の機能が阻害されたり（いわゆるドミナントネガティブの効果）や、ありえない状況が生まれて本来とは異なった活性を示してしまうということは十分に考えられます。

レポーターアッセイはまあ多くの場合転写活性とかでしょうから、あまりそういうのを考えることは行われていないのですが、そもそもレポーターが本当にその活性を評価しているかという点においては実はかなりアバウトなものも多いと思います。ルシフェラーゼアッセイも実際はおもっている以上にトリッキーですし、まああくまで詳細な検討のためのある条件下での評価という位置づけであったり、スクリーニングの指標にしか過ぎないのが現状です。

この辺はどこまできちんと評価するかに限るのであって、例えばGFPで特定のタンパク質の局在を評価する（これも広義ではレポーターですよね）系であってもN末C末あるいは内部にあのデカイタンパク質をつけて問題ないのか？また発現量が過剰な場合局在自体がありえないことになっていないかなどの評価もじつは難しいです。例えば仮にそのタンパク質が毒性があるとかであればうまく導入できた細胞は死んでしまうため、一部の”運良く”死なないレベルの発現のものだけを評価しているかなりセレクションのかかった集団を評価している可能性もあるわけです（実際効率の悪いフシフェラーセアッセイなんかは見かけ上わからなくてもありうる）。

結局のところ何が言いたいのかというと、人工的に作り出した条件である以上何かがおかしかったらそう言う可能性はありうるということです。細胞レベルでそうだからといってマウス個体でそのような機構があるかもわかりませんし、さらにヒトで同じ機構があるかもわかりませんよね。だからといっていきなりヒトでやらなければ意味がないというわけでもなくてある現象を評価する一定の条件下でどのような結果になったから次にこうして見るということであって、その過程の中でレポーターが原因で問題になっているという考察はあってもいいということです。逆に行ってしまうと、考察として常に問題になるかというと、、、ルシフェラーセアッセイの場合はそうでもないような気がします。
まあ、どのレベルの論文を目指すかによっても違いますけどね。

この回答へのお礼

詳細な回答ありがとうございます。
考えながら読ませていただきました。

生きたままの状態で遺伝子の発現を観察できるとは言っても、人が手を加えている以上は自然な状態とは言えないし、目に見えているものが必ずしも正確な情報だとは限らないのですね。
うーん…！

勉強になりました！
ありがとうございました。

お礼日時：2013/03/20 15:14

No.1 回答者： ga111 回答日時： 2013/03/19 07:46

あまり詳しくありませんが。

一過性でレポータが遺伝子がある場合は、一過性であるがゆえに、それほど問題になりません。
恒常的にレポータが遺伝子がある場合は、それで生存しているので、一過性の反応を見る場合、それほど問題になりません。

また、レポータが遺伝子はそれほど毒性がないものが使われるので、それほど問題になりません。

例外的には、レポータ遺伝子のプロモータに転写因子がくっつきすぎて、奪い合いで毒性を発揮することが、可能性としてあるでしょう。でも、あまり起こりにくいでしょうね。たぶん。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
質問させていただいた疑問点はどうやら私の勘違いからきていたようですが、勘違いを正しく認識し直した上でさらに勉強になりました。
レポーター遺伝子が細胞に与える影響というのは問題になるほどではないのですね。
こうした可能性を考えるのは興味深いものがあります。

まだまだ勉強不足の部分があるようです。確実に抑えていきたいと思います。
ありがとうございました。

お礼日時：2013/03/20 00:18