プラスミド抽出法について

初めて質問させていただきます。

現在大学の研究で大腸菌からプラスミドを抽出する実験をしています。
キットによる小スケール (5 ml スケール) での抽出はうまくいったため
自作の試薬を用いた大スケール (30 mlスケール) での抽出を行ったところ、
電気泳動の結果でバンドがラダー状になっており、目的のバンドが確認できませんでした。

様々な資料をもとに試薬調製の検討やプロトコールの検討を行いましたが
なぜラダー状になるのかがわかりません。
どなたかご存知でしょうか？

ちなみにアルカリ-SDS法 → イソプロ沈殿したサンプルを電気泳動しました。
最終溶媒はTE バッファーです。

No.1 回答者： 1fan9 回答日時： 2015/10/07 19:12

同じプラスミドでもスーパーコイル、オープンサーキュラー、リニアーの形態を取るのでそれが一つの原因と思います。

https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sb …

折り紙の環っかつづりのようにプラスミドの環が二つ以上つながるケースもあります。これらの要素が組み合わさると単一のプラスミドを泳動してラダー状になってもおかしくありません。
スケールを上げてラダーになった理由は分かりませんが抽出方法が違うとニックの入り方等が違うのでそういうことが影響しているかもしれません…。

ラダーのあるプラスミドをある制限酵素でしっかり切ったときに、バンドの出方が正しければOKです。たとえばEcoRIで一箇所切れるプラスミドの場合、プラスミドDNA消化後に出るバンドは一つです。
その際、キットを用いて取得した方をコントロールにおいてみると良いと思います。

それでもバンドの出方がおかしいなら複数種のプラスミドかRNAが混じっているかもしれません。