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えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。

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A 回答 (4件)

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。


>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。
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この回答へのお礼

お礼、遅くなり申し訳ありません!!
細かいご指導ありがとうございます!

早く技術が進んで溶離液にカラーがついたりしてて、
外観で「あ、今溶離液がちゃんと交換できた!」とか確認できる時代になればいいなぁ~
なんて希望を抱いてしまいますねぇ。
え?それよりもちゃんと勉強した方が早い??
ごもっともです。(^^;)

とにかく週明け、がんばってみます。

お礼日時:2001/11/04 22:53

 Organomets さんのお書きの様に,系内の溶離液交換が不十分なように思います。

「メタノ-ルを流してみる」との事ですが,緩衝液を使用されている事を考えると,水での洗浄もされる方が良いかも知れません。

 なお,溶離液を交換する際には,直接新しい溶媒に変えるのではなく,両溶媒と双溶性のある溶媒に一旦交換してから目的の溶媒に変える方が安全です(もちろん,新しい溶媒自身が双溶性があれば直接変えても構いません)。特に緩衝液を使用している場合は。

 以前の質問「QNo.153029 HPLC初心者です!」(↓)でご紹介したカラムメ-カ-のペ-ジに溶離液交換時の注意事項なども載っていたと思います。ご覧になってみて下さい。

Organomets さん
> 溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
> することもよくあります(答えになっていないけど)。
 これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

参考URL:http://www.okweb.ne.jp/kotaeru.php3?q=153029
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この回答へのお礼

お礼遅くなり申し訳ありません。

それにしても今まで溶離液の交換にここまで気を使ってなかったんで
ちょっと今までのことが心配になってきました。(^^;)

とにかく、月曜は水の洗浄から始めますね!
ありがとうございました!!

お礼日時:2001/11/04 22:48

念のため申し上げておきますが、溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。

カラム内の溶離液交換の際は、マニュアル記載の方法に従ってください。グラジェントが出来るとベターなんですけどね。

検出器の耐圧限度にもよりますが、検出器の出口に不要カラムを接続し、背圧をかけて洗浄すると効果的な場合もあります。

ただし分析用カラムがベースライン不安定の原因である場合には、それ以外の部分をいくら洗浄しても安定化にはつながりませんから注意してください。

いずれにせよ原因不明のままでも溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決することもよくあります(答えになっていないけど)。
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この回答へのお礼

>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
すいません、知らないことだらけで・・・。

>いずれにせよ原因不明のままでも溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決することもよくあります
不思議となぜかそういうことってありますよね。

今回はものぐさせずにメタを流してみます。ありがとうございました。

お礼日時:2001/11/02 10:44

順相で検出波長が比較的短い場合に同様な経験をしたことがありました。



私自身はきちんと答えられるほどの知識は無いのですが、もう少し情報があると皆さん答えやすいように思います。

検出器はUVですか? 波長は(安息香酸ということで大体予想はつきますが)? ポンプ圧が徐々に変動するようなこと(脈流とは違います)は無いでしたか? ランプの寿命はどうでしょうか? 安息香酸の保持時間やピーク形状に変動は見られませんか? 測定室の温度変化、というよりも測定温度の変動はありませんか? カラムヒーターがついていてもカラムから検出器までのラインが剥き出しでエアコンの風があたってたりするとアウトです。そして移動相交換時の系内の置換は確実ですか? 

こんなことを言うのは失礼ですが、移動相を変更した際にトラブルが起きるのは系内が充分に置換されていない理由によるものが多いです。緩衝液を使用していると無機塩の追い出しにだけ気をとられてしまいがちですが、有機溶媒のみでも洗浄したほうが良い場合も多々あります。検出器の種類にもよりますがセル近辺には結構汚れがたまりやすいので不安でしたらマニュアルに従って分解→洗浄確認することも重要かと思います。ベースラインに変動をもたらすほどではないにしても、ヤニ化している微量成分のこびりつきは稀にあり、これがピークとして現れたりすると分析自体が無効になります。

とりあえず思いついたことだけ記しました。
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この回答へのお礼

詳しいアドバイスありがとうゴザイマス!

検出器はUVで、ポンプ圧は正常、ランプ寿命もオッケー、
測定温度もおそらくは大丈夫だと思います。

ということは置換が問題なのですかねぇ??
一回メタくらいで洗浄をやってみることにします。

本当に、ほぼ独学でやってるので知識がなくてすいません。
アドバイスとてもありがたいです。

お礼日時:2001/11/02 10:40

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 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

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ここで注意が必要なのは、【化粧品"100g"中に有効成分Aは何g含まれているか】となっていることです。厳密には100mlと100gは同じ量を表していません。化粧品100mlの密度(g/ml)が分かればこの値を0.32にかければ【化粧品"100g"中に有効成分Aの量】が出せます。密度が不明なときは、例えば100mlを正確に量り取ってから、その質量を精密天秤で測ってください。質量÷体積で密度が計算できます。

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

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基本的なHPLCの条件として、カラム:ODSカラム、移動層:85%メタノール+10mM酢酸アンモニウム、流速:1mL/min、検出波長:325nm
で測定を行っています。
比較的、逆相で早く出てくるレチノールなどの物質はこの条件で測定していますが、レチノイドの中でも脂溶性の物質をこの条件で測定しようとすると、保持時間が長くなってしまい、1サンプルの測定にかかる時間が長くなってしまいます。
そこで、文献にのっている条件で、グラジエントをかけて測定してみることにしました。
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