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仕事で特に分取用に液クロを使っています。つい油断して,気付いたら移動相が空になっていました。プレッシャーが落ちると自動的に停止する仕組みになっているため「気付いた時には機械が止まっていた」という状態だったのですが,もしかしてカラムに空気が入ってしまったか?という不安がぬぐえません。その後再び移動相を流したのですが,ベースラインが安定しない,試験的にサンプルを打ってみるとピークがブロードになり別物のようである,RTが変わっている,等の症状が出ています。カラムは(C18)ODS,移動相はアセトニトリルです。これはどう判断したらよいでしょうか,またもしこのカラムにエアーが入ってしまった場合はどう対処すればよいでしょうか?どなたかご存知の方,ご教授下さい。

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A 回答 (1件)

停止直後であれば,逆方向から送液するという手もあったんですが...


空気が入ると,ベースライン変動が周期的にうねったり,周期的にパルス状のノイズが出たりします.小さなパルスくらいなら,背圧をかけたりゆるめたりする程度でも取れたりすることもありますが,そこまでいってしまうと,いさぎよく,そのカラムはあきらめて,新しいものを買うというのが,まあベストではありますね.
ダメ元で試すなら,カラム温度をできるだけ下げ (たとえば氷欲),配管等が許す範囲で可能な限り高圧で,移動相をひたすら流すことでしょうか.
温度を下げるのは,移動相に対する空気の溶解度を上げ,また気泡の体積を少しでも小さくするためで,高圧にするのも同じです.
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この回答へのお礼

ありがとうございました,とてもよくわかりました。>ベースライン変動が周期的にうねったり,周期的にパルス状のノイズが出たり という症状らしきものを直後に確認しました…やはりこれはエアーが入ってしまったと判断せざるを得ないですね。ダメ元対策をさっそく試してみます。丁寧なご説明,深謝致します。

お礼日時:2008/04/19 08:37

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QまたまたHPLCで教えてくださいな!

えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。

Aベストアンサー

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も...続きを読む

Qカラムの乾燥… もう使えないのでしょうか?

ゲルろ過クロマトグラフィーで用いる、Sephadexゲルの平衡化をしている最中に、操作を誤りゲルを枯らしてしまいました。
カラムクロマトグラフィーで樹脂は乾燥させないようにとよくいわれますが、これは何故なのでしょうか?私がざっと調べたところ、ゲルの中に気泡が入るのを防ぐためという記述がありましたが、どのゲルもこのような理由だけで乾燥を嫌っているのでしょうか?
もしそうだとすると今回乾燥してしまったゲルは再び膨潤からやり直せば使えるものなのでしょうか?

Aベストアンサー

ゲルは乾燥すると収縮します。当然体積が減るのでカラムのベットボリュームは減りますが、そのまま溶媒を圧送して再膨潤させると、ゲルは潰れてしまいます。ですから再膨潤させるときは一度ゲルをカラムから出して再膨潤させ、充填しなおす必要があります。気泡の問題だけではないのですよ。上手に再充填できればカラムの理論段数は保持できますよ。

QHPLCのカラムのはずし方

HPLCのカラムをはずし、めくらネジをつけるとき、入り口からやりますか?出口(検出器側)からやりますか?はずすときの注意事項もあったら、あわせてお願いします。

Aベストアンサー

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Qリン酸のモル濃度

市販のリン酸(85%)のモル濃度と規定度がわかりません。誰か優しい方教えて下さい、お願いします。

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こんにちは。お世話になります。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

QHPLCカラムの洗浄方法

逆相のカラムは使用後に必ず水で洗浄した上で、適当な水:溶媒系に置換するものだと思っていたのですが、今私が勤務しているところでは、誰も水で洗いません。ていうか、50%アセトニトリルを流すことを「洗浄」と称しています。実際、これでいいんですかね?

Aベストアンサー

#6です。お恥ずかしい限りです。
おっしゃる通り、「水:メタノール=9:1」の間違いです。別の分析条件でよく使っていたのでついつい・・・。

それから、#7さんの回答でもうひとつ思い出しました。どのようなバッファーだったかは忘れましたが、移動相をメンブランフィルターに通してからでないと使えないものがありました。

brassardさんの直面している条件で有効かどうかわかりませんが、予防の意味で一度試してみては?

既に同様の処置を済ませた上でのご質問でしたらご容赦下さい。

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む

QHPLCの負のピーク

HPLC初心者です。
HPLC分析結果に、どの物質を分析しても必ず1分台に負のピークが出てしまうのですが、
これはなぜなのでしょうか。
また、負のピークは本来なら出てはいけないものなのですか?
わからないことばかりですみません。
どなたかお願い致します。

Aベストアンサー

私の経験から先に結論を言いますと、負のピークがでても測定に問題ありません。
  但し、インジェクション部、カラムの接続部等に問題がないことが前提です。
  もう一度各部を点検してください。


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