ミニプレップ

キアゲンのミニプレップを用いてプラスミドを抽出しています。
最近、突然DNAの収量が悪くなってきました。
特にプロトコールを変えた訳ではないのですが。
ご助言いただければ幸いです。

No.3 ベストアンサー 回答者： popporu 回答日時： 2006/01/11 11:50

PE buffer でwashしたあとに、メンブレンをちゃんと乾かしてからElutoしていますか？

乾燥が不十分だと収率が悪いように思います。
そのときの気候によるのかキットの古さによるのか、何なのかわかりませんが、
一回washして後、13000rpm、1minで遠心してもだめなときがあります。
15000rpmにするとか、もう一回の遠心乾燥ステップを増やすとかすると収率が改善するように思います。
(遠心をお使いの場合ですが。バキュームではやったことないのでわかりません。)

この回答への補足

ご回答いただき、ありがとうございます。
乾燥はしていませんでした。
プロトコールに書いてありましたでしょうか。
PEで洗浄した後、もう１分追加で遠心してアルコールを除くようにはしています。
うちの卓上遠心器は14000までできるので、スピードを上げてみるとともに、もう１回遠心を増やしてみようと思います。
（ちなみに収量ですが、80ng/μl程度まで下がってます）

補足日時：2006/01/11 11:59

No.4 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/01/11 12:10

＞recipe等ご存知でしょうか。

200 mM NaOH, 1% SDS

マニュアルのAppendixに出ています。

この回答へのお礼

ありがとうございました。
恐らく、両方ともラボにあるので、作成してみます。

お礼日時：2006/01/11 12:37

No.2 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/01/11 11:17

トラブルの原因になりやすいのはBuffer P2（NaOH/SDS）です。

開封して時間がたつと、空気中の炭酸ガスで中和されてきます。
また、最近、気温が低いですが、析出していたりしませんか？

思い当たる節がありましたら、新しいボトルを開けるか、自作しましょう。

この回答への補足

ご回答いただき、ありがとうございます。
当ラボは、このキットを共有して使用していますので、誰がどれくらいの頻度で使っているのかよくわかりません。
析出はしていませんが、新しいP２ボトルを開けてみようと思います。
自作もできるのですね。
recipe等ご存知でしょうか。

補足日時：2006/01/11 11:55

No.1 回答者： blackdragon 回答日時： 2006/01/11 11:06

マニュアルどおりの操作をしていますか？

（各ステップの時間等）

プラスミドを取る菌株の培養には、きちんと、選択培地を用いていますか？

また、用いている抗生物質が古くなって失活していることはありませんか？

培養温度は変えていませんか？

この回答への補足

ご回答いただき、ありがとうございます。
マニュアルどおりの操作をしているつもりです。
ただ、最近使ったコンピテントセルがGC5というもので、これはDH5αに相当するということを今日知りました。
マニュアルには、PBでwashする必要は無いと書いてありますが、従来どおり洗浄していました。
次回からこのPB500μlによるwashを省こうと思ってます。
なお、グリセロールストックから菌を起こして一晩シェイクするとよく濁りますし、大腸菌はそれなりに増えていると思うのです、抽出の段階のどこかに問題があると考えています。

補足日時：2006/01/11 11:54