in situに用いる固定液について

　現在in situ hybridizationを行なおうと思い、色々本を読んでますが、固定液について質問です。
　成書には、とにかくRNaseフリーにするために、DEPC処理とか、乾熱滅菌とか色々書いてありますが、経験者によると、実際はそれ程気にしておらず、特にRNaseについて気にしてないようでした。
　では組織が持つ内因性のRNaseはどう気をつけてるの？と聞いたら、アルデヒドで固定する為に、気にしないレベルになっていると思う、との答えでした。
　さて前置きが長くなりましたが質問です。
普通in situの固定にはホルムアルデヒド固定を行い、架橋結合により併せて酵素も失活出来ると思いますが、アルコール固定のみによる変性固定では、RNaseの失活は期待できないでしょうか？
　質問の意図としては、ホルムアルデヒドを作るのが面倒なのと、架橋によるプローブの浸透が阻害されるような気がするので、アルデヒド固定を省くことが出来れば、いろいろ良いことがあるんじゃないかと思ったのです。
　面倒ですが、どなたか示唆を頂ければありがたいです。

No.1 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/03/18 18:58

RNaseの最大のソースは材料の生物組織です。

それでもRNAのISHができるのは、固定によってRNaseが失活するからです。固定標本を得るまステップまではRNase-freeにこだわる必要はありませんし、その後も普通にきれいな器具、試薬を使えば組織中のRNAが分解されるほどのRNaseのコンタミはまず起こりません。
ネガティブコントロールのために標本をRNase処理したものを使うという方法もありますが、なかなか効いてくれないものですよ。

アルコール固定は単なる脱水による固定なので、組織中のRNaseの失活は全く期待できません。それができるなら、RNAの取り扱いがどれだけ楽になることか。。。
ちゃんと固定をほどこした上で、界面活性剤、有機溶媒（DMSOなど）やプロテアーゼなどで処理して、プローブの浸透やターゲットRNAの暴露を高めます。

この回答へのお礼

わかりにくい、変な質問に答えてくれてありがとうございました。アルコール固定のみではRNaseは失活しないのですねえ。以前何かの雑誌で（細胞工学か何か)
ISHをする時に、エタノールでエンブリオを固定して云々。。と言う記事があった記憶があって、「それは楽だなあ」と思った記憶があったんですが、やっぱり無理なんですね。

お礼日時：2006/03/19 23:03