バンドが見えない

PCR後、増幅していることを確認し、カラムで精製して、再度、確認として1%アガロースゲルで泳動したらバンドが確認できませんでした。これまでこのようなことはありませんでした。自分のミスかと思い、もう一度やり直したのですが、結果は同じでした。PCR産物の濃度が薄くなっているだけなのでしょうか？その他バンドが見えない原因として考えられることがあったら教えてください。宜しくお願い致します。

No.3 ベストアンサー 回答者： upako217 回答日時： 2006/06/03 18:09

こんにちは。

その後バンドは見えるようになりましたか？
もう解決しているといいのですが。
カラムで精製した後なくなったというので比較的やりやすいミスで浮かぶのが、

Et-OHを入れてないwash bufferを使ってしまった（これは新しいキッドをおろした時ですが）

Elutionの時に、Elution液をメンブレンの上に直接のせなかった（tubeの壁についてしまっていた）。

ということです。
きっと確認されていると思いますが、一応と思って書かせていただきました。
けっこう単純なことでも、何度注意深く確認しても気がつかないことがありますよね。

なんやかんやと時間がかかる実験なので、早く原因がわかるといいですね。

この回答へのお礼

ご回答ありがとうございます。再度、細かい部分まで確認していきたいと思います。

お礼日時：2006/06/05 07:55

No.2 回答者： MIYD 回答日時： 2006/06/03 15:35

>載せたDNA量とeluteの量も問題があるのではないか？

載せたDNAの量が初めから検出限界以下ならば、100%回収できて、それを全量流したとしても検出できません。
eluteした時のvolumeが、eluteされるDNAを検出限界以下にまでに薄めてしまう量でしたら、検出できません。
こんな回答を聞きたいわけではないと思います。

本当に"1ulをeluteしていました"という操作をしたのならば、
メーカーのプロトコルと全く違う操作をしているので、
精製できなくてもあたりまえだと思います。
30ulでeluteして、その1ulを泳動したというのでしたら、そのように書かなければ、誰も貴方の行った操作を理解できません。

質問文と補足から得られる情報だけで、バンドが見えない理由が出てくると考えて書かれているのでしょうか。
自分の操作でどこに問題があるのかを聞きたいのでしたら、
どのような操作をしたか
（PCR後の目的のフラグメントのサイズと量、メーカーのプロトコルと異なる操作をしているのならば、その操作、elute後の濃度のチェックの仕方など）
を書いて、
新しく質問しなおした方が良いかと思います。

この回答へのお礼

確かに質問の仕方がいけませんでした・・・。ご指摘ありがとうございました。

お礼日時：2006/06/05 07:50

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2006/05/30 19:28

操作ミス、カラムの不良、アガロースの不良、UVランプが切れていた

などを並べていっても参考にならないと思いますが。

どのメーカーのどのカラムで、
スケールはいくつで、何ngを入れて何ulでeluteした
などの情報がないと、こめんとのしようがないとおもいますが。

薄くなっているだけと書いているということは、
載せたDNA量と、eluteしたvolumeに何らかの問題があると考えているのですか？

この回答への補足

補足が遅くなってしまい申し訳ありません。使用しているキットはVIOGENEのPCR-M Clean Up Systemです。普段も1ulをeluteしていました。載せたDNA量とeluteの量も問題があるのではないか？とも考えてはいます。

補足日時：2006/06/01 08:22