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浮遊細胞のMTT assayをやり始めました(HL60細胞株です)。
ある論文を参考に、細胞をまいてから24h放置し、試薬の添加を行うのですが、この24hの細胞増殖の速さが毎回まちまちで再現性のあるデータがなかなか取れず困っています。
この24h放置というのは付着細胞にしか必要ない気がするのですが、実際はどうなのでしょうか?
また、実際同じようなことを行っている方がいらっしゃれば、どのように行っているのか教えてください。

よろしくお願いします。

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A 回答 (3件)

HL60って細胞同士がくっつきませんか?


くっついたままだとバラツキの原因になります
96wellのような小さなスケールでやる時は特に注意が必要です
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この回答へのお礼

遅くなってしまいすみません。
ご返事ありがとうございます。

細胞数を減らし、よくほぐしてから行うようにしたら安定するようになりました。

お礼日時:2007/09/01 09:40

最近の文献であれば、問い合わせのためのe-mailのアドレスも記載されていると思います。

指導教官と連名で、authorにメールして問い合わせてみては如何ですか。ここで聞くより、早いし、細かい所も質問できると思いますよ。
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この回答へのお礼

遅れてすみません。
ご返事ありがとうございます。

今回はautorにメールを送ることはしませんでしたが、自分たちで解決することができました。

今後、問題が発生しましたら、メールで問い合わせることも考えていきたいと思います。
自分たちだけでは、どうしてもわからないことってありますよね。

お礼日時:2007/09/01 09:45

HL60でMTT assayをしている論文を参考にしていないのですか?



http://www.cmi.ustc.edu.cn/3/6/467.pdf
http://jn.nutrition.org/cgi/content/full/136/3/614

ところで、薬剤を添加していない状態で、
24hインキュベートして細胞増殖が異なるのに、
試薬を添加した時に細胞増殖への影響を見る事が出来るのですか?
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この回答へのお礼

ご返事ありがとうございます。
HLの文献はもちろん見ていますが、細胞をまいてから何時間後に試薬を添加したのかを記述していない論文が多いのです。そのため細胞をまいた直後に試薬添加をしたのか、それとも何時間か置いてから試薬添加をしたのか、判断しかねています。

>>ところで、薬剤を添加していない状態で、
>>24hインキュベートして細胞増殖が異なるのに、
>>試薬を添加した時に細胞増殖への影響を見る事が出来るのですか?

おっしゃるとおりで、そのために現在立ち往生しています。

お礼日時:2007/08/02 12:40

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よろしくお願いします。薬剤による細胞増殖の違いを見るアッセイを行いたいのですが、コラーゲンゲル内で培養している細胞なので困っています。最終的にASSAYの最終段階ではコラゲナーゼなどで溶かして細胞を単離したりするのは問題ないですが薬剤を効かせる段階ではゲルの中で行いたいのですが。MTT ASSAYをはじめとして他にどのような系があるか教えていただきたいのですがよろしくお願いします、。

Aベストアンサー

おそらく、細胞をはがさなければいけないところが問題、ということですね?

MTTとほぼ同じ原理で、WST-1という試薬があります。この試薬はMTTと違い、細胞を溶解させる必要がありません。細胞を培養している100uLの培地にこの試薬を10uL加えて1時間程度まって、吸光度を測定するだけです。「加えて、待って、測定」だけです。
メリットは浮遊細胞でも容易にできるし、takkun35さんのように、特殊な環境でも使用できることです。
デメリットは、試薬がやや高めと言うことです。確か、ROCHEのもので、2500well分で2万から3万円の間だった気がします。自分でMTTの粉を溶かすよりは高いですが、MTTのキットに比べれば、それほどでもないと思います。

結果もMTTに比べ、細胞を溶解するところでのぶれがなくなるためか、 WST-1の方がかなり安定します。

なお、WST-1と似たもので、同仁(和光で取り扱い)からWST-8という試薬もでています。私の経験ではWST-1よりさらに安定した結果がでます。

takkun35さんの系は試薬を付加している時間を長めにとった方がよいかもしれません。

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QMTTアッセイ時のコツについて教えてください。

現在、阻害剤を使った細胞の増殖活性実験をMTTアッセイを用いて行っています。

その際にウェルの付着した細胞のみを対象としたいために(浮遊細胞はいらないです)、MTTを入れてインキュベートした後に、96ウェルをひっくり返して上澄みを捨てる方法と、ピペットで1ウェルずつ上澄みを吸い上げて捨てる方法を取っているのですが、どうも値のズレが大きく信用性がありません。このようなMTTアッセイにはコツなどがあるのでしょうか?

それと一般的な阻害実験の場合には、1ウェルに入れる細胞数などというのはだいたい決まっているのでしょうか?

MTTアッセイを初めて行うような初心者ですので、初歩的な質問かと思いますがご教授よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

細胞の数は実験よってことなりますが、接着細胞でよく増える細胞なら3000/wellゆっくり増えるもので10000/wellぐらいでしょうか。

接着細胞の場合は浮いている細胞は大抵死んで(調子が悪くなって)浮いてくるので、バイチに直接MTTをほりこんで、反応後は溶液(バイチ)を捨てずにSDSなどでをくわえてフォルマザンをようかいするという手があります。ちょっとフォルマザンは溶かすには手強いですが、可溶化の方法はほかにもあるかもしれません。

コントロールでもばらつきますか?それによっても判断が変わるかもしれません。薬剤処理の細胞ははがれやすくなってるかもしれませんね。MTTは細胞の数をミトコンドリアの酵素の活性を測定して見積もるものです、薬剤が酵素活性に直接または間接的に作用すると何か予期せぬことがおこる可能性があります。
方法を改良したにもかかわらずうまく行かない場合は違うあっせいをためしてみるのもてかもしれません。ほかにこのようなキットがあるます。細胞が壊れて出てきた酵素を測る方法です。

http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=1410001

参考URL:http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=1410001

細胞の数は実験よってことなりますが、接着細胞でよく増える細胞なら3000/wellゆっくり増えるもので10000/wellぐらいでしょうか。

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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

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動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

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限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

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プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q遺伝子の読み方について

遺伝子やタンパク質の読み方についての辞典、または一覧のようなものはないでしょうか?
例えば、Wntは「ウィント」と読むと思うのですが、最初に見たときはなんと呼んでいいか分からず、「ダブリューエヌティー」と呼んでいました。
今後このようなことは避けたいので、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

こういった問題はとても難しいです…。
正解というのはなくて、せいぜいが一般的な、と言う程度ですね。

MAPK マップカイネース
ERK アーク
Akt アクト 、エーケーティーも可
XIAP ザイアップという人もいるがエックスアイエーピーのほうが多かった。
PTEN ピーテン
catenin カテニン
APC エーピーシー

というわけで、規則性なし…!
エライ先生が学会で話したことがそのまま受け継がれることもあるらしいのでこういった辞典はないでしょうね…。

Qシグナル伝達分子達の読み方

単純に知りたいというだけなので恐縮ですが、、、。
シグナル伝達に関わるタンパク質分子って、アルファベットで略語みたいな名前がついてますよね?
この子達の読み方が知りたいのです。
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で、「Jun」は「ジュン」なの?
「myc」「myb」「gab」「Smad」「JAK」「STAT」「JNK」「FAK」とか。
まあ、一部は予想はできるけど、あってんの?って感じですので。
ひとまず、お手すきの方、知っているものを挙げてほしいです。
お願いします。
あ、あとちょっと関係ないけど「SUMO」はやっぱり「スモー」なんですか?

Aベストアンサー

あっているかどうかは判りませんが、私の読み方を・・。
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QPBSとTBSの使い分けについて

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ニューフクシンで発色するプロトコールでは、
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なぜ、二つの緩衝剤を使い分けるのでしょうか?
どなたか免疫染色に詳しい方、回答頂ければ幸いです。

Aベストアンサー

リン酸がアルカリフォスファターゼを阻害するからです

QT検定とMann-WhitneyのU検定の使い分け

ある2郡間の平均値において、統計的に有意な差があるかどうか検定したいです。ちなみに、対応のない2郡間での検定です。

T検定を行うには、ある程度のサンプル数(20以上程度?)があった方が良く、サンプル数が少ない場合には、Mann-WhitneyのU検定を行うのが良いと聞いたのですが、それは正しいのでしょうか?
また、それが正しい場合には実際にどの程度のサンプル数しかない時にはMann-WhitneyのU検定を行った方がよろしいのでしょうか?
例えば、サンプル数が10未満の場合はどうしたらよろしいのでしょうか?

また、T検定を使用するためには、正規分布に従っている必要があるとのことですが、毎回正規分布に従っているか検定する必要があるということでしょうか?その場合には、コルモゴルフ・スミノルフ検定というものでよろしいのでしょうか?

それから、ノンパラメトリックな方法として、Wilcoxonの符号化順位検定というものもあると思いますが、これも使う候補に入るのでしょうか。

統計についてかなり無知です、よろしくお願いします。

Aベストアンサー

結局ですね、適切な検定というのは適切なp値が得られるということなんですよ。適切なp値というのは第1種の過誤と第2種の過誤をなるべく低くするようにする方法を選ぶということなのですね。

従来どおりの教科書には「事前検定をし、正規性と等分散性を仮定できたら、、、」と書いていありますが、そもそも事前検定をする必要はないというのが例のページの話なのです。どちらが正しいかというと、どちらも正しいのです。だから、ある研究者はマンホイットニーのU検定を行うべきだというかもしれませんし、私のようにいかなる場合においてもウェルチの検定を行う方がよいという者もいるということです。

ややこしく感じるかもしれませんが、もっと参考書を色々と読んで分析をしていくうちにこういった内容もしっくり来るようになると思います。

Qウェスタンブロットのサンプルのinputの意味

今呼んでいる分子生物学系の論文なのですが、ウェスタンブロットの結果のFig中に
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微妙に専門外なのでホントに基礎的なことだったらすみません。
詳しい方解答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

正確な表現ではないですが数式で書くと
Input = IP+ flow through となります。
入れた物 = 抗体についた物+つかなかった物
ただ全量泳動することはできませんので、一般にNo.1のかたが書かれたように1% Inputとか10% inputとして泳動します。
抗体反応中の分解や容器等への付着、洗浄中の脱落および吸着の定量性を示したい場合にはflow throughを示しますが、一般にIPのデーターでは、どのようなサンプルを使用し、抗体でどの程度濃縮されたかを示すにとどめますので、ご質問の3つのレーンとなります。inputには、使用したサンプルにどのくらいの量の目的の因子が入っていたかを示す意義が主ですが、論文中のどこにも%を書いていないものもあります。そのときには、単にそのバンドの高さを示すのみの意味になってしまいます。
メンブレン全体をfigureにする場合には、inputのレーンが抗体の特異性などを示すために使うこともあります。
ご参考までに。

QDMSOの除去について。

現在、植物の抽出物を使用して
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活性試験を行っています。

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活性を示す化合物の単離も目指しているのですが
量が少ないサンプルについて
一度活性試験のために
DMSOに溶解したサンプルを
NMR解析に使用したいと考えています。

DMSOを除去する必要があるのですが
DMSOはどうやって除去したら良いでしょうか??

沸点が高いので
エバポレーターで除去するのは難しいな…
と思い、今現在は凍結乾燥を視野に入れているのですが
他に何か、良い除去方法をご存知の方はぜひ教えてください。

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

原則使わないのがいいと思います。活性評価がどういった系なのかわからないのですが、
生物活性などの場合はスケールを下げて行えば一部を数ul に溶かして使い捨てで十分ですよね。そんな程度ならNMRとったところでピークは出ないでしょうし、その程度しかないなら多分今後の構造決定まで
いくのは困難な気がするのですが、、、。


どうしてもというなら、ご参考までに。


エバポで除去しにくい高沸点溶媒はどうやって除去するの?*1

水との親和性が高いものは分液する。
目的物と極性が違う場合はカラムで分ける。テーリングに注意。
加熱と減圧を併用する。目的物が分解したり蒸発しないか確認しておく。
再沈澱or再結晶でどうにかする。

非プロトン性極性溶媒
基本的に分液して落とす。
有機層にエーテル使うのが便利。ハロゲン系溶媒は何故か全然ダメ。
低極性高沸点溶媒
太くて短いカラムを何度か通して抜くしかない。
含水メタノールとヘキサンで分液振れ。
なお、むやみに熱をかけなければいかないような分子内DA反応は、反応設計が間違っている場合がほとんど。
取り除くことを考えるより、使わないことを考えた方がいい
DMF
真空ポンプを繋げて濃縮すれば結構いける。
希塩酸で洗うとサクッとなくなる
DMSO
水入れて凍結乾燥する。NMRの測定溶媒はこの方法が便利。
DMSO, DMF
ヘキサン-酢酸エチル=4:1で分液。2,3回抽出の後、水で2回ほど洗浄するとなくなる。
なおクロロホルムで抽出すると水相にはほとんど行かずに、これらの溶媒は有機層にくる。これを利用してカルボン酸などの場合は目的物をアルカリ水相に回収して、酸性にしてから酢酸エチルで抽出するというテクニカルな方法もある。

参考URL:http://wikiwiki.jp/bake-tech/?%A5%A8%A5%D0%A5%DD

原則使わないのがいいと思います。活性評価がどういった系なのかわからないのですが、
生物活性などの場合はスケールを下げて行えば一部を数ul に溶かして使い捨てで十分ですよね。そんな程度ならNMRとったところでピークは出ないでしょうし、その程度しかないなら多分今後の構造決定まで
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QIC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻害物質の濃度をふって(10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01ug/mL)
それぞれの阻害率を求めて、エクセルで検量線を作って
その式に当てはめて50%の値を求めたらよいのかな、と思ったのですが…
普通に散布図にしたら変な形のグラフになってしまいました。
いろいろ調べた結果、IC50を求めるときはx軸が対数のグラフを作るのでしょうか?
そのとき、阻害物質(x軸)の濃度の振り方も異なってくるのでしょうか?
(たとえば10, 5, 2.5, 1.25, 0.625…のほうが良いとか)

正直、数学が苦手でして対数にする意味などはさっぱりです…
どなたか、ご回答よろしくお願いいたします。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

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という風に行っていました。
なので、阻...続きを読む

Aベストアンサー

どんなグラフなのかわからないのであれですが

とりあえず、貴方の実験も対数でされているので問題無いです(0.01, 0.1, 1, 10, 0.05, 0.5, 5で実験しているので)
今回の実験をリニア(普通の)軸で取ると、一番右端が10になり左端が0.01≒0になります
真ん中が5、左から1/10が1になるので、右半分は殆どデータがなく左側にばかりデータ点が並ぶことになります
しかも、0.01と0.05, 0.1当たりの違いはグラフで書いて理解するのは困難だと思います
ですので、対数軸を使います
対数軸ですと、0.01と0.1が一目盛、0.1と1が一目盛となるのでデータ点が均一に並びます
あとは、10倍では飛びすぎているので、間の点として5を選んだということで、それぞれの間に5x10^nのデータが並びます

データ点はある程度規則的に並んでいた方が良いですが、厳密に取る必要はないです
(リニア軸でいうと1, 1.6, 2, 2.6, 3, 3.6などでも良い)
ですので今回の濃度のままで問題ないと思います


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