ブロッティングについて

Question

現在、ウェスタンブロッティングを用いて実験を行っています。
皆様のご意見などを参考にさせて頂きたいと思い、投稿させていただきました。
以下の点について皆様のご意見をお聞かせ頂ければ幸いです。

ブロッティング時の電圧
 当方では現在ブロッティングをATTO社のブロッティング装置を用いてセミドライ式で行っております。
ブロッティング条件は、「定電流150mA、時間60min、ゲルサイズ9cmx9cm」で行っております。
その際に電圧が、開始30V程から終了60V程まであがってしまいます。濾紙や膜は30分以上バッファーに浸けています。
これはやはり電圧が高すぎるでしょうか。
(参考書では定電圧で２５～３５Vとなっている為)
 
　原因として考えているのは、「装置に濾紙を重ねるさいに濾紙を持ち上げても水滴が
落ちないくらいまで水気をきり、重ねる際には特にバッファーをかけていないため濾紙の
水気をきり過ぎている」のではと考えています。皆さんはどの程度の電圧でされていますでしょうか。

長々と失礼いたしました。至らない文章でわかりにくいとは思いますが、よろしくお願い致します。

otx · Accepted Answer

＞開始30V程から終了60V程まであがってしまいます。

あのう、ブロッティング開始してすぐの電圧は30Vですよね？
それが時間が経つにつれて電圧が上がって終了時は60Vなんですよね？

ある程度電圧が上がるのは当たり前だと思います。
私のシステムでは２倍くらいに電圧が上がります。
問題はないですけど。

ブロッティング時間はどのくらいですか？
１時間くらいで通常は行うのですけど、
長いなら、そりゃ電流を維持するために電圧はあがりますよ。
（２時間までくらいが普通、でも個人的には長いと思います）

ウエスタンがうまくいっていないのでしょうか？
もし、そうでないのなら、別に許容しても良い範囲ではないでしょうか。

Mr_Spock · Answer

バッファーに通電すれば、分極が起こって抵抗が上昇するのは当たり前で、電気泳動の時だってそうでしょう。定電圧とか、定電流とか言うのは、電圧、電流のどちらのパラメータを一定に設定するかということで、他方のパラメータは抵抗値が変化するのに応じて変わります。中学理科で習ったはずのE=IR、抵抗が上がっていくならば、定電圧なら電流量が下がっていくし、定電流なら電圧は上がっていきます。逆に言えば、抵抗が変化しうる以上、電流、電圧の両方を一定には出来ないから、定電流と定電圧のオプションがあるわけです（定電力、つまり電圧値と電流値の積が一定というオプションのあるパワーサプライもありますけれど）。

SANSUI77 · Answer

１．転写は巧くいっていますか？　濾紙やメンブレンがこげていませんか？
２．ブロッターはきれいですか？　塩が析出していませんか？　バネは全てきちんと働いていますか？
３．ゲルと濾紙、メンブレンの大きさは同じにしていますか？
４．きちんと空気は抜いていますか？

Dr_Hyper · Answer

実験はうまくいっているけど、電圧の変化が気になるということですか？
穿った見方をすれば、一応検出できているけども効率がわるいのではないか。もっとキレイに転写されるのではないかということでしょうか。
単純にはbufferが熱で蒸発してしまっているのかなと思いました。
もうすこしひたひたにしてトライされてみたらいかがですか？
転写効率は他の面でいろいろ方法はあります、メンブレンの種類とtransfer bufferの組成などが重要です。

ブロッティングについて

＞開始30V程から終了60V程まであがってしまいます。

バッファーに通電すれば、分極が起こって抵抗が上昇するのは当たり前で、電気泳動の時だってそうでしょう。

この回答への補足

１．転写は巧くいっていますか？ 濾紙やメンブレンがこげていませんか？

実験はうまくいっているけど、電圧の変化が気になるということですか？

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