高速液体クロマトグラフ(HPLC)で内部標準法を採用したいと思っているのですが、
内部標準としては何が一般的なのでしょうか?
HPLCに詳しくないので、ご存じの方、是非、お願いいたします。

今後の一般的な知識としても欲しいのですが、現在、欲しいと思っているのは
 カラム:ODS系(ex.shim-pack CLC-ODS)
 移動相:MeOH/リン酸緩衝液系
で用いれるものです。

是非、よろしくお願いいたします。

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A 回答 (2件)

基本的なところはNO.1で答えられているとおりですが、ピークの理論段数やシンメトリー係数なども問題でしょうし、当然検出波長で吸収をもつ物質が前提となります。



参考までに、UV検出器で、質問されている条件において、測定波長が254nm付近と仮定すると、パラオキシ安息香酸エステルなど汎用されているようです。
パラオキシ安息香酸、同メチル、エチル、プロピル、ブチルなどは、ご質問の条件において、保持時間が遅くなっていきますので、わりと使いやすいと思います。
保持時間が近すぎる場合でも、移動相のpHを変えたり、メタノールをアセトニトリルにかえるだけでも、分離はかなり異なってきます。
内標準物質を設定する上では、予め移動相を決定しておくのではなく、内標候補のいくつかから、さらに移動相条件を変えていって分析条件全体を設定する方法が一般的だと思います。

経験則上、割と有効な方法を
 水/MeOH系では、有機溶媒の量を移動相の比率で10%増やすと、保持時間は約半分になります。アセトニトリル系だと約1/2~1/3になります。もちろん移動相のpHにも影響されますが、大体当てはまるので、内標を探すときの保持時間調整に使えます。

ぴったりした分析条件が見つかったときってうれしいもんですよ。
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基本的には、測定されるものと反応しないもの、ピークがかぶらずに検出器で検出されるものでしたら何でもいいと思います。

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HPLCでの分析初心者です。
サンプル抽出時に、内部標準を加えることによって何が変わるのですか?基礎的なことだと思うのですが、難しくてよくわかりません。すみませんが、わかりやすく教えてください。

Aベストアンサー

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するために調製した溶液 (processed sample) を 200 microL にするとします。

I.S. が、100% 回収できたとすれば、processed sample 中の絶対量は、S mg/ 200 microL = 5S mg/mL になりますね。このうち 20 microL を HPLC に Load するとすれば、I.S. は、0.5S mg 入ることになります。これに対応する Response (Ri) が、観察される筈です。

実際には、抽出過程でのばらつきがあるため、観察される Response は、Sample により R'i のようにばらつくはずです。この R'i / Ri を絶対回収率 (Absolute Recovery) と言います。

同じように、検量線の場合は、加えた Ci は既知ですから、同じように Absolute Recovery を求めることができます。

次に、各 Sample 内での、Analyte と I.S. の関係を考えます。Matrix 中には
 Analyte Ci
 I.S. S
入っていますね。この両者の、抽出などの過程で生じる Absolute Recovery が、一定値 (多少のばらつきはありです) a だったとすれば、processed sample 中には、
 Analyte aCi
 I.S. aS
となるので、量は変化しますが、Analyte / I.S. の比は、一定になります。そこで、上げられた例のように、aS に由来する Response のばらつきは a に依存するので、Response がばらばらになることはありえます。ここで、Analyte の Absolute Recovery が、常に I.S. のそれに等しいのであれば、Analyte の Response も aCi になるので、Analyte / I.S. は、もともとの Matrix 中の比と同じになるので、検量線が、きれいに引けることになります。

これがまさに内標準法を採用する一つの目的です。検量線は、添加した濃度 (Concentration added) に対し、HPLC で得られる Analyte と Internal Standard の比 (Ratio of onserved Value) を回帰して、求めます。

これとは別に、絶対検量線法というのもあって、これは Analyte の Response そのものを回帰します。挙げられた例をこの方法で回帰したときには、ろくな検量線にはなりえませんね。これは Sample ごとの、Absolute Recovery のばらつきが大きいのです。このようなときにも、同じような Recovery を示す I.S. を用いることで、補正しているのです。


さて、もうひとつの方というのは、ここまでの話でお分かりのように、Analyte / I.S. が一定である、ことをまず証明、
 具体的にはある狭い範囲での直線性を確認します。
した後、単独の試料に一定量の I.S. を加え、分析。Response の比から、濃度を出してしまうものです。これは、単なる溶液になっているなど、Matrix が単純な場合用いる方法です。予想値が高い場合は、希釈する程度の操作で済むときに使います。実際の使用例は、動物に薬物を投与するときの溶液 (正式な用語は、被験物質調製混合物) の濃度検定 (きちんとした濃度でなければ投与量が計算できませんから)、被験物質調製混合物中の被験物質の安定性 (調製した後一定条件下で保存している間に壊れないかどうか) を調べるときに用いています。No. 2 が言われているのは、これに相当します。

参考に挙げたのは、FDA の正式 Document で英語ですが、実際にどういう目的で用い、どういう処理をするか、判定基準も含めて、きちんと記載しています。可能であれば、一度読んでみてください。検量線の処理方法などは、世界的に authorize されているのはこの文書だけです。

参考URL:http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.htm

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するため...続きを読む

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Aベストアンサー

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