「制限酵素によるDNAの完全な切断」の定義をおしえて下さい。

1) 制限酵素認識領域を含むDNAをPCRで増幅
　　↓
2) DNAを精製
　　↓
3) 制限酵素処理
　　↓
4) DNAを精製
　　↓
5) 4)をテンプレートとして1)と同じプライマーセットでPCR
　　↓
6) 1),3),5)のサンプルを電気泳動でチェック

というような行程で実験を行ったのですが、5)で1)と同様のバンドが検出されました。
これは、3)でDNAが完全に切断されていないということだと思うのですが、制限酵素の取説通りの「制限酵素によるDNAの完全な切断」を行うための操作しっかりと行ったはずです。
どなたか「制限酵素によるDNAの完全な切断」の定義をおしえて下さい。
よろしくお願いします。

No.3 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/12/11 11:35

「完全消化」といっても、一分子も切れ残りがないかどうかは証明するのは困難です（「存在する」ことの証明より「存在しない」ことの証明は難しいです）。

個々の実験系で、どの程度の厳密さが要求されるかは違うとでしょう。
EtBrの検出限界で判断すればよしの場合もあるでしょうし、バイブリや末端ラベルでより感度の高い方法で証明する場合もあるでしょう。

ところで、今回のケースでは実は完全消化できていたけれど、PCRで全長の産物ができていたという可能性も高いと思います。たとえば、4塩基の5'突出末端を生じる制限酵素で切った場合、両端のプライマーから合成されたDNAは、3'末端が4塩基の相補配列になります。それがアニールしてDNAが合成すると完全長の鋳型となりますので、普通にPCRで増えてきます。

この回答へのお礼

>完全消化できていたけれど、PCRで全長の産物ができていたという可能性も高いと思います。

実は酵素処理の切れ残りがテンプレートとして増幅したわりにバンドの輝度が高く、不可解に思っていましたが、これで納得がいきました。ありがとうございました。

お礼日時：2005/12/12 10:00

No.2 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2005/12/11 00:47

制限酵素処理も酵素反応である以上「完全」な反応は無理でしょう。

99.9％は可能かもしれませんが1分子も含まない、となると不可能と思います。
制限酵素で切った後、ゲル濾過（で除けるのかな？？）のような工程を経ればいいかもしれませんが・・・
ただ切った後電気泳動を行い、そこから切り出しを行えば
切ったもののみにすることは可能かもしれません。
もちろんコンタミには十分注意せねばなりませんが酵素反応のみよりは確率が高いでしょう。
ただ現実として泳動の際に少しは漏れたりしますから1分子も含まないものを得るのは相当難しいと思います。
切り出したゲルをよく洗ったりすれば少しはましになるか・・・でも100％除去は辛い感じがします。
あとはプライマーの精製に使うHPLCとかならいけるかも？？

この回答への補足

やはり１００％を求めるのは厳しいようですね。

また、ご提案ありがとうございました。
実は、今後の展開としてPCR産物ではなく細菌からの抽出DNAを対象するためゲル濾過やHPLCによる精製はできない事情があります。

補足日時：2005/12/12 09:46

No.1 回答者： kokichi 回答日時： 2005/12/09 10:07

完全の定義をどうするのか？ということですが、目的によって違ってくるように思います。

電気泳動でとりあえず見えなければよしとしたり、大腸菌用のベクター（ライブラリ作成用など）では導入して薬剤耐性株がでてこなければよしとしています。

制限酵素での切断を電気泳動で確認されているかと思いますが、あれはかなりの量がないと切れ残りを検出できないので目安程度です。制限酵素での切れ残りは常にあるものと考えて実験系を組む必要があります。実際に、精製しても（これが曲者）切れ残りを完全に除去するのは困難です（理由は精製に使ったキットなどの原理を考えてみてください）。

この回答へのお礼

ご回答ありがとうございます。
とても参考になりました。

細菌から抽出したDNAの長さを確実に数百kb以下の長さにする必要があり、その方法として制限酵素を選択したのですが、やはり切れ残ってしまうものなのですね。他の方法を検討してみます。

お礼日時：2005/12/09 10:34