マスト細胞モデルであるRBL-2H3細胞を購入したのですが、文献に従って脱顆粒させようとしてもしません。細胞内の顆粒が動くのは確認できるのですが、いわゆる脱顆粒はしません。刺激はA23187、抗原抗体反応、ブラジキニン、Compound48/80、ConA、マストパラン・・・文献に従って、あらゆるものを試してみました。培養方法も購入先のマニュアルにしたがっています。培養条件、刺激条件等検討してみましたが、コツみたいなものがあるのでしょうか。何卒、宜しくお願いいたします。

このQ&Aに関連する最新のQ&A

値 文献」に関するQ&A: 文献値について

A 回答 (2件)

ご返事が遅くなってしまい,申し訳ありません.


私は,以下の方法で脱顆粒を確認したことがあります.
簡単ですので,一度試されてはいかがでしょうか?

細胞浮遊液(100000cell/1.8mL)を37℃で5分インキュベート.
2.0μg/mL-Compound 48/80 200mLを添加.
もちろん,Ca ionophoreでもできました.
ちなみに,細胞の浮遊及びCompoundの調製に用いた液は,0.1%-BSA添加Tyrodeです.

以前,脱顆粒を確認後に,脱顆粒の結果遊離してくるヒスタミンの量を定量したことがありますが,Compound濃度を上記に設定した場合,45%前後でした.濃度を上げても50%を越えることはほとんどありませんでしたし,様々な文献でもこれくらいの値でした.もちろんβ-ヘキソサミニダーゼも定量しましたが,やはり文献通りでした.

私の紹介した方法でも脱顆粒を確認できない場合,細胞浮遊液や,細胞も改めてみる必要がありそうですね.
    • good
    • 0

こんにちは.もし差し支えなければ,細胞を浮遊させたときのbufferの組成,pHや刺激物質の濃度など,どのような流れで実験されたの

か細かく教えていただけますか?

この回答への補足

お返事ありがとうございます。以下に、実験条件を示します。


培養条件
RPMI-1640 10%FBS,または
RPMI-1640 15%FBS

70%コンフルまで培養し、siraganinan bufferで3回洗浄後、37℃で、
刺激1
5uM A23187 (siraganinan buffer)
4uM A23187 (siraganinan buffer)
1uM A23187 (siraganinan buffer)
500nM A23187 (siraganinan buffer)

刺激2
bradykinin f=5ug/mL

刺激3
ConA f=50ug/mL

IgE f=0.5ug/mLでインキュベート(一時間、またはオーバーナイトで)後、
刺激4
DNP-BSA f=20ng/mL


です。宜しくお願いいたします。

補足日時:2002/01/30 15:03
    • good
    • 0

このQ&Aに関連する人気のQ&A

お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!

このQ&Aを見た人はこんなQ&Aも見ています

このQ&Aを見た人が検索しているワード

このQ&Aと関連する良く見られている質問

QRBL-2H3からの脱顆粒

RBL-2H3細胞の脱顆粒反応をβ-ヘキソサミニダーゼの酵素活性で評価しようと考えて実験を重ねているのですが一向に脱顆粒がおきてくれません。
刺激はIgEと抗原、あるいはA23187で行っていて、
培地はRPMI1640で刺激時は1%BSA含有タイロードバッファーです。
ちなみに細胞密度は3×10^5で、96ウェルに100μL撒いてます。
色々と反応条件を変更してみたりしたのですが一向にうまくいかず、
しかも細胞内量を測定すると普通に測定できているので酵素反応が悪いというわけではなさそうです。
つまりなぜだかわからないけど脱顆粒だけがうまくいかないという状況です。
同じような経験をされた方や原因を思いつく方がおられましたらアドバイスをください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

RBL-2H3がIgEを介して脱顆粒反応を起こすにはいくつかの条件があります。
抗原の条件などは確認しているものとしてお答えします。
まず、RBL-2H3が均一な細胞ではないということに注意しなければなりません。
例えばA研究室で使っているRBLとB研究室で使っているRBL、さらにATCCから購入したRBLでは細胞表面のFcεRI(高親和性IgEレセプター)の発現量が異なる可能性があります。
さらに、FcεRI下流の細胞内シグナル伝達に必要なLynやSykなどのキナーゼやCD45の発現量も違うかもしれません。
まずはそのあたりをウェスタンやFACSなどで調べてみてはいかがでしょうか?
今回の質問の場合はA23187刺激においても脱顆粒しないということですので、A23187とホルボールエステルであるPMAとの共刺激をしてみるといいと思います。
また、2,30%の脱顆粒反応しかしない場合は細胞数が少ないと確認できない可能性も考えれれますので、1.5mlチューブのようなもので細胞数を増やしてみるのも1つの手だと思います。

QHEK細胞、HeLa細胞および初代培養細胞株について

HEK細胞、HeLa細胞の違いってなんでしょか?
現在読んでいる論文に頻繁に登場してくるのですが。

HEKが小児の胚由来、HeLa細胞が子宮頸がん由来ということはわかっているのですが、実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

HeLaは癌細胞由来だから癌細胞のアッセイなどに使って、HEKは正常細胞を見たいときにつかうということでしょうか?

あと初代培養細胞株と通常の細胞株の違いって、初代培養細胞株は培養条件や形質転換の条件が確立されていない点で扱いにくいという理解でよろしいのでしょうか?
では初代培養細胞の利点は何かあるのでしょうか?

当方化学系の研究室に所属しているので身近に質問できる人がいません。なにとぞよろしくおねがいいたします。

Aベストアンサー

これをまずは見てみて下さい。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa4078187.html

>実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

自分の実験で扱いやすいと思った方を使うだけです。
この二つの細胞は、遺伝子導入が容易いので、よく使いますが、
どっちが良いのかというのは個人の判断です。

>HeLaは癌細胞由来だから癌細胞のアッセイなどに使って、HEKは正常細胞を見たいときにつかうということでしょうか?

いいえ。どちらも既に正常細胞ではありません。正常細胞はあくまで初代培養細胞です。この二つはどちらもずーっと分裂し続けます。

>あと初代培養細胞株と通常の細胞株の違いって、初代培養細胞株は培養条件や形質転換の条件が確立されていない点で扱いにくいという理解でよろしいのでしょうか?

確立されていないということはありません、ただ、効率が悪かったりします。上にあげたURLにあるように、初代培養細胞はまず集めることや、培養自体が難しいとかありますので、総合的に実験しづらいです。

>では初代培養細胞の利点は何かあるのでしょうか?

所詮、293細胞やHeLaは「細胞株」でしかありません。
試験管ではない、細胞を使った解析は出来ますが、それはあくまで
この二つの特殊な細胞でそうなるということにすぎません。
最後の決めの実験はやはり、実際の細胞ではどうなのか?ということを証明しなくてはなりません。

例えば、腸の細胞での話をしていて、最初は293細胞で実験をやっていて得られた結果を、細胞はやはり腸の細胞で証明しないとダメだということです。

293とHeLaなどの「細胞株(cell line)」は実験に使いやすい
汎用実験用細胞といった感じのものです。

これをまずは見てみて下さい。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa4078187.html

>実験を行う上での選択の基準は何でしょうか?

自分の実験で扱いやすいと思った方を使うだけです。
この二つの細胞は、遺伝子導入が容易いので、よく使いますが、
どっちが良いのかというのは個人の判断です。

>HeLaは癌細胞由来だから癌細胞のアッセイなどに使って、HEKは正常細胞を見たいときにつかうということでしょうか?

いいえ。どちらも既に正常細胞ではありません。正常細胞はあくまで初代培養細胞です。この二...続きを読む

Q培養細胞へのトランスフェクション時の培養ボリューム

ヒトの培養細胞を使ってsiRNA実験(メーカーによりすでに効果が確認されているコントロールsiRNA)を行っているのですが、96穴プレートでは効果が低い(40~50%減)のですが、48穴プレートでは効果が高い(70~80%減)傾向があります。おそらくトランスフェクション効率の問題だと思うのですが、培養ボリュームによって差が出ることってあるのでしょうか。培地、試薬、細胞数は同じロットのものをウェルの培養面積の変化と同じ割合で量を変えています。プレートのメーカーは違うのですが表面加工は同じです。トランスフェクション後48時間で見てます。細胞はHepG2です。そんなに使いにくい細胞ではないと思うのですが。

また以前に行ったルシフェラーゼアッセイのプラスミドを入れる実験でも同じように培養ボリュームでトランスフェクション効率が変わるような印象をもっています。このときもHepG2ですが。

おそらくどこか実験系にミスがあるのだろうとは思うのですが、どこをどうしたらよいのかわかりません。

培養ボリュームの違いによる結果の違いについて、同じような経験をされた方、聞いたことがある方、何かご存知でしたら教えてください。

ヒトの培養細胞を使ってsiRNA実験(メーカーによりすでに効果が確認されているコントロールsiRNA)を行っているのですが、96穴プレートでは効果が低い(40~50%減)のですが、48穴プレートでは効果が高い(70~80%減)傾向があります。おそらくトランスフェクション効率の問題だと思うのですが、培養ボリュームによって差が出ることってあるのでしょうか。培地、試薬、細胞数は同じロットのものをウェルの培養面積の変化と同じ割合で量を変えています。プレートのメーカーは違うのですが表面加工は同じです。トランス...続きを読む

Aベストアンサー

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。
ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
実験をしていると感じていると思いますが、96-well plateで均一に細胞をまくことは結構難しく、どうしても中心に寄ってしまうからです。
siRNAを行う際、検体数の多いときは私も96-well plateを予備実験に使うことはありますが、本データは6-well plate以上の大きさでやっています。理由は96-wellでは均一にまくことが難しく、細胞密度が高くコンフルエントな中心部分ではトランスフェクション効率が下がり、結果がばらつくからです。もちろん、コストも飛躍的に上がりますが(笑) どうしても、多穴プレートでやる場合は、wellの外周部分にピペットで滴下するように細胞をまき(中心部にはまかない)、揺らさないようにするのが、コツといえばコツでしょうか。何回かやってみるとある程度は改善されますが、やはり10cm dishのような均一さを出すのは難しいです。

また、トランスフェクション効率そのものを確認したいのでしたら、蛍光のついたsiRNAなんかを購入してトランスフェクションするのも一つの方法です。細胞をばらして顕微鏡で観察すればどの程度の細胞に導入されているかが視覚的に確認することができます。

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。
ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
実験をしていると感じていると思いますが、96-well plateで均一に細胞をまくことは結構難しく、どうしても中心に寄ってしまうからです。
siRNAを行う際、検体数の多いときは私も96-well plateを予備実験に使うことはありますが、本データは6-well plate以上の大きさでやっています。理由は96-wellでは均一にまくことが難しく、細胞密度が高...続きを読む

QHeLa細胞を培養していたら長細い細胞が目立ってきました・・・

培養を始めて1ヶ月程度のものです。
HeLa細胞を2週間前から培養しています。
最近細長い細胞が1割程度を占めてきました。
特にこれといって問題はないのですが、こんなことはよくあることなのでしょうか?
やはり腕が悪いのでしょうか?

Aベストアンサー

こんにちは。

Helaはもともとクローン化されていないラインですし、細胞の形態は一通りではありません。培養の時期とか、FCSなどの要因によっては顔つきが変わることもあるでしょうし、全体としてみた場合の性質も変わることがあるかもしれません。それ自体は普通に起こりうることです。結果に統一性を持たせるためには、実験目的に即してpasasge数を厳密にそろえるとか、クローニングするなど考慮しましょう。

Qマスト細胞について

すみません、教えて下さい。
免疫に関係する「マスト細胞」それ自体について知りたいです。いろいろな書には免疫の説明の一部として名前だけ出ています。普通の細胞とどうちがうのか(核はあるのか、小器官はあるのかなど)、この細胞についてどんな研究がされているのか、可能な限り教えて下さい。

Aベストアンサー

まずは、Wikipediaで確認しては?
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E8%82%A5%E6%BA%80%E7%B4%B0%E8%83%9E

さらに、詳しい話は、Medlineで調べ、
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed
原著論文に当たるのが良いと思います。


このQ&Aを見た人がよく見るQ&A

このカテゴリの人気Q&Aランキング

おすすめ情報