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マスト細胞モデルであるRBL-2H3細胞を購入したのですが、文献に従って脱顆粒させようとしてもしません。細胞内の顆粒が動くのは確認できるのですが、いわゆる脱顆粒はしません。刺激はA23187、抗原抗体反応、ブラジキニン、Compound48/80、ConA、マストパラン・・・文献に従って、あらゆるものを試してみました。培養方法も購入先のマニュアルにしたがっています。培養条件、刺激条件等検討してみましたが、コツみたいなものがあるのでしょうか。何卒、宜しくお願いいたします。

A 回答 (2件)

ご返事が遅くなってしまい,申し訳ありません.


私は,以下の方法で脱顆粒を確認したことがあります.
簡単ですので,一度試されてはいかがでしょうか?

細胞浮遊液(100000cell/1.8mL)を37℃で5分インキュベート.
2.0μg/mL-Compound 48/80 200mLを添加.
もちろん,Ca ionophoreでもできました.
ちなみに,細胞の浮遊及びCompoundの調製に用いた液は,0.1%-BSA添加Tyrodeです.

以前,脱顆粒を確認後に,脱顆粒の結果遊離してくるヒスタミンの量を定量したことがありますが,Compound濃度を上記に設定した場合,45%前後でした.濃度を上げても50%を越えることはほとんどありませんでしたし,様々な文献でもこれくらいの値でした.もちろんβ-ヘキソサミニダーゼも定量しましたが,やはり文献通りでした.

私の紹介した方法でも脱顆粒を確認できない場合,細胞浮遊液や,細胞も改めてみる必要がありそうですね.
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こんにちは.もし差し支えなければ,細胞を浮遊させたときのbufferの組成,pHや刺激物質の濃度など,どのような流れで実験されたの

か細かく教えていただけますか?

この回答への補足

お返事ありがとうございます。以下に、実験条件を示します。


培養条件
RPMI-1640 10%FBS,または
RPMI-1640 15%FBS

70%コンフルまで培養し、siraganinan bufferで3回洗浄後、37℃で、
刺激1
5uM A23187 (siraganinan buffer)
4uM A23187 (siraganinan buffer)
1uM A23187 (siraganinan buffer)
500nM A23187 (siraganinan buffer)

刺激2
bradykinin f=5ug/mL

刺激3
ConA f=50ug/mL

IgE f=0.5ug/mLでインキュベート(一時間、またはオーバーナイトで)後、
刺激4
DNP-BSA f=20ng/mL


です。宜しくお願いいたします。

補足日時:2002/01/30 15:03
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