酵素反応を行うときに、どうして緩衝液を用いるのですか?酵素には一番働くpHがあると聞いたのですが、反応するとpHが変化するからですか?いろいろ教えてください。

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A 回答 (3件)

最適pHについて。


酵素の実体は、たんぱく質です。たんぱく質は、ご存知かもしれませんが、
20種類ほどのアミノ酸が特定の配列でつながったヒモのようなものです。
このヒモが、ヒモの構造的な制約, 側鎖の性質, 周辺の環境で、ある立体構造を
とります(その他、糖鎖による修飾や、複数のたんぱく質が結合したりと、
いろいろあるようですが省きます)。
この立体構造をとることで、基質が酵素の一定の部分(活性中心)に結合して、
酵素は触媒の機能を持ちます。

酵素に最適pHがあるのは、pHによってこのアミノ酸側鎖のかい離状態が
変わることによって、基質が結合する部分(活性中心)の性質が変化したり、
立体構造が微妙に変化するためではないかと考えます。
また、NADやATPの場合、基質の状態もpHにより変化します。

蛇足ですが、pHを極端に変えると、たんぱく質の立体構造が不可逆的に
変化します。
(例 牛乳に酢を入れるとヨーグルトのようになる。)

緩衝液を用いる理由
酵素の反応速度は、上記のようにpHに影響されますので、反応速度を測定する際
に、どこでだれが測定しても、同様な測定結果がでるようにpHを一定に保って
測定を行う必要があります。
そこで、緩衝液を使用して、pHを一定にして測定を行います。
shu_sさんのおっしゃる通り、反応によるpHの変化よりも、添加する基質による
pHの変化を防ぐのが主目的だと思います。
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酵素には至適pHというものがあり、それによって反応速度が変化します。


詳しくは参考URLをご覧下さい。

参考URL:http://homepage1.nifty.com/j-soyo/bs/bs1.htm
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酵素には一番働くpHのことを一般用語で『至適(してき)pH』といいます。

緩衝液を用いるのは反応するとというのもそうですが、用いる基剤の追加などでもpHが変化しやすいからです。酵素によって至適pHは異なるのでそれぞれにあわせた緩衝液を調整します。
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Q酵素溶液の保存方法

酵素溶液の保存方法について教えてください。

1.制限酵素のように、50%グリセロールの状態にし、-20℃で良いのでしょうか?
2.酵素の種類によっては、グリセロールで失活することもあるのでしょうか?

保存したい酵素はザイモリアーゼです。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ザイモリアーゼをちょっと手元にある本で調べました。イーストのプロトプラスト調製に使う細胞壁分解酵素のようですね。メーカーのキロンビールに直接聞くのが一番正確で早く正解が得られると思いますよ。

Q緩衝液の選択

 実験で様々な緩衝液を使っています。
しかし何故、その緩衝液なのか?
ということが分かりません
例えば酵素を使う実験の際に最適pH近辺で
緩衝能が最大になるように緩衝液を選択するのは
分かります。しかし、数ある緩衝液の中から
選択される緩衝液の種類には偏りが
あるように思うのですが、どうゆうことでしょうか?
緩衝能やpKaが数種類あるなどが理由になっているので
しょうか?

Aベストアンサー

緩衝液の選定には、緩衝能力と緩衝液の成分との相互作用を考える以外に、「安い」ということもポイントになります。研究室のほとんどのものが、毎日使うものですから費用もバカにはなりません。

 学生時代は、貧しい研究室だったのでほとんどリン酸緩衝液でした。
 卒業後に、リン酸緩衝液は、不純物として金属が多いので、その影響を避けるために、Tris-HClにした測定を考えました。そのときに、「Trisは値段が高い」と聞いていた学生時代の記憶で、50mMにすることができず、中途半端な30mMの緩衝液で測定するようになってしまいました。

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

QKm値について

Km値について

Km値は基質に対する酵素の親和性だと習いました。
Km値が大きくなるほど、親和性が上がるということでしょうか。
ミカエリスメンテンのグラフからはKm値が小さくなるほうが、親和性が上がる気がするのですが。

わかる方、回答よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

>>Km値が大きくなるほど、親和性が上がるということでしょうか。

逆です。
ミカエリス定数はV=(Vmax・C)/(Km + C)で表されます。(Vは反応速度、Vmaxは最大反応速度、Cは基質濃度)

ミカエリス定数Kmが大きいと、分母が大きくなり、反応速度Vは小さくなります。

反応速度が小さいと言うことは、基質との親和性が小さいということを意味します。

Q酵素の基質特異性と活性部位について

タイトルどおりですが、
酵素の基質特異性と活性部位の違いがよく分かりません…。
説明お願いします。

Aベストアンサー

酵素は、分子全体で働くというよりも、その一部で基質に働き掛けます。
基質と形状が合致する構造を持っているわけです。この、基質と合致する構造部分を、「活性部位」といいます。
そして、個々の酵素は、その「『活性部位』の形に合った基質」しか相手にできません。つまり、個々の酵素は、それぞれに決まった基質しか相手にしないのです。この性質のことを、「基質特異性」といいます。

良く使われる比喩で言います。

鍵(キー)は、あのギザギザの部分でドアを開けることができるので、ギザギザ部分が活性部位にあたります。キーのその他の部分(たとえば飾りの付いた頭の部分とか)はキーの、ドアを開けるという作用には無関係です。

そして、個々のキーは、決まったドアしか開けられません。
ドアが基質に当たりますが、ドアの鍵穴が、キーの「活性部位」とピッタリ合う場合に限って開けられます。

私のキーは私の自宅のドアを開けられますが、あなたのキーでは私の家のドアは開けられません。
私のキー<-->私の自宅のドア
あなたのキー<-->あなたの自宅のドア
という、決まった1対1の関係が成り立っているわけです。
この、対応関係が固定されているということが、基質特異性です。

酵素は、分子全体で働くというよりも、その一部で基質に働き掛けます。
基質と形状が合致する構造を持っているわけです。この、基質と合致する構造部分を、「活性部位」といいます。
そして、個々の酵素は、その「『活性部位』の形に合った基質」しか相手にできません。つまり、個々の酵素は、それぞれに決まった基質しか相手にしないのです。この性質のことを、「基質特異性」といいます。

良く使われる比喩で言います。

鍵(キー)は、あのギザギザの部分でドアを開けることができるので、ギザギザ部分が活性...続きを読む

Q酵素の反応停止液について

酵素の反応停止液ってどうやってきめているのですか?酸性のものを使うときもあれば塩基性を使うときもあるし・・・。
今回実験で基質にp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを使い、酵素にヒト胎盤ALPase/5mM炭酸緩衝液溶液を使って酵素活性に対するpHの影響について実験した時に、反応停止液に0.25M水酸化ナトリウム溶液を使用しました。
基質が塩基側に至適pHを持つからですか?ちょっと判らないので御願いします。

Aベストアンサー

酵素が反応するpHからはずれていれば酸性、塩基性
どちらを用いてもOKです。
今回の場合は、pNPの発色が塩基性側で黄色くなることから
水酸化Naを加えていると思います。

QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む

Qe^xを微分するとe^xになる理由

大学1年のものです。

(e^x)'=e^xの証明がわかりません。
高校で習ったような気もしますが、習ってないような気もします。

ここの過去の質問も見させてもらったところ、2つほど見つけたのですが、

1)
y=e^x
logy=x
(1/y)y'=1
よって  y'=y=e^x



2)  e^xを無限級数に直して微分



1)の場合d(logx)/dx=1/x…(*)を利用していますが、(*)は(e^x)'=e^xを利用せずに証明できるのでしょうか?

2)の場合、e^xを無限級数に直すためには、テーラー展開をしないとダメなような気がするのですが、テーラー展開をするときに(e^x)'=e^xを利用しなければならないような気がします。



1)、2)とも(e^x)'=e^xの証明に(e^x)'=e^xを利用しているとすればこれらは意味を成さないような気がするのですが…


微分の定義に沿って証明しようともしましたが、

(e^x)'=lim{h→0}(e^x((e^h)-1)/h)

となり、ここで行き詰ってしまいました。



(e^x)'=e^xはなぜ成り立つのでしょうか?
よろしくお願いします。

大学1年のものです。

(e^x)'=e^xの証明がわかりません。
高校で習ったような気もしますが、習ってないような気もします。

ここの過去の質問も見させてもらったところ、2つほど見つけたのですが、

1)
y=e^x
logy=x
(1/y)y'=1
よって  y'=y=e^x



2)  e^xを無限級数に直して微分



1)の場合d(logx)/dx=1/x…(*)を利用していますが、(*)は(e^x)'=e^xを利用せずに証明できるのでしょうか?

2)の場合、e^xを無限級数に直すためには、テーラー展開をしないとダメなよ...続きを読む

Aベストアンサー

orangeapple55さんのおっしゃるとおり、「一般的には」1)も2)も(e^x)'=e^xを用います。
従って1)にも2)にも頼らず、定義によって微分することにしましょう。

(e^x)'
=lim[h→0](e^x((e^h)-1)/h)
=e^xlim[h→0]{((e^h)-1)/h}

となるので、結局問題は
lim[h→0]{((e^h)-1)/h}……(*)
の収束性に帰着します。

そこで、この極限について考察してみましょう。以下、適宜e^xをexp(x)と表現します。

まず、h>0のときについて考えましょう。
このとき、exp(h)>1ですから実数t>0を用いて
exp(h)=1+1/t……(1)
と表すことができます。

指数関数は連続ですから、
lim[h→0]exp(h)=1
ゆえに
lim[h→0]t=∞
つまり、
h→0のときt→∞……(2)
が成り立ちます。

また、h=log(exp(h))を利用すると、(1)よりh=log(1+1/t)……(3)
ですから、(1)、(2)、(3)より、(*)はtを用いて
(*)=lim[t→∞]1/{tlog(1+1/t)}=lim[t→∞]1/log{(1+1/t)^t}
と書き直すことができます。

さて、対数関数も連続ですから、
lim[h→0]log{(1+1/t)^t}=log{lim[h→0]{(1+1/t)^t}}です。
そこで、lim[h→0]{(1+1/t)^t}に注目しましょう。

nを自然数とします。そうすれば、二項定理を用いて
(1+1/n)^n
=1 + nC1*(1/n) + nC2*(1/n)^2 + …… + (1/n)^n
=1 + 1 + (1-1/n)/2! + (1-1/n)(1-2/n)/3! + …… + (1-1/n)(1-2/n)……(1-(n-1)/n)/n!……(4)
と展開できます。

(1+1/(n+1))^(n+1)
を同じように展開すると、(1+1/n)^nに比べて
イ:項数が増え
ロ:個々の項が増大する
ことが容易に確認できますから、(1+1/n)^nはnが増すと単調増加します。
しかも、(4)より、

(1+1/n)^n
<1 + 1/1! + 1/2! + …… 1/n!
<1 + 1 + 1/2 + 1/2^2 + …… + 1/2^(n-1)
<1 + (1-(1/2)^n)/1-1/2
<3

ですから、(1+1/n)^nは上に有界(どんなnをとってきても(1+1/n)^n<MとなるMが存在する。今の場合例えばM=3)です。

ここで公理を使います。
「上に有界かつ単調増加な数列は収束する」
これは実数の連続性を認めないと出てこない公理なのですが、今はとりあえず認めることにしましょう。そうすると、

「(1+1/n)^nは3以下のある値に収束する」

ことが分かります。これを私たちはeと定義したのでした。
以下、証明は省きますが、xを実数としても、(1+1/x)^xはやはりx→∞でeに収束することは容易に類推できると思います。
(証明が気になるなら図書館で解析に関する本を探してみてください。おそらく載っていると思います)

さて、このeを底にとった対数関数を自然対数logと決めたのですから、結局のところ
log{lim[h→0]{(1+1/t)^t}}=log(e)=1
が出ます。よって、(*)=1、つまり、(e^x)'=e^xを示すことができました。h<0についても同様です。

適当なことを言いたくなかったので、長くなってしまいました。すいません。
整理すると、
(1)(1+1/x)^xはx→∞で2.71ぐらいに収束する(収束値をeと名付ける)
これが一番最初にあります。これを用いて、
(2)e^xを指数関数とする
(3)logxをその逆関数とする
これが定義されます。この順番を理解していないと、おかしな循環論法に陥ります。

(注:冒頭で「一般的には」と書いたように、これと違った定義の仕方もあります。
たとえばe^x=1+x/1+x^2/2!+……と先に指数関数を定義してしまう方法。
これらに関しても、順番に注意すれば循環論法に陥らずに公理のみから件の命題を証明することができるでしょう)

最後に、僕は以上でいくつか仮定をしています。
対数関数が連続であること。指数関数が連続であること。
実数の連続性。(1+1/x)^xはxが実数であってもx→∞でeに収束すること。
これらの証明(あるいは公理の必然性)をあたってみることは決して無駄ではないと思います。

orangeapple55さんのおっしゃるとおり、「一般的には」1)も2)も(e^x)'=e^xを用います。
従って1)にも2)にも頼らず、定義によって微分することにしましょう。

(e^x)'
=lim[h→0](e^x((e^h)-1)/h)
=e^xlim[h→0]{((e^h)-1)/h}

となるので、結局問題は
lim[h→0]{((e^h)-1)/h}……(*)
の収束性に帰着します。

そこで、この極限について考察してみましょう。以下、適宜e^xをexp(x)と表現します。

まず、h>0のときについて考えましょう。
このとき、exp(h)>1ですから実数t>0を用いて
exp(h)=1+...続きを読む

Q制限酵素の取り扱い

制限酵素を使った実験を行いました。
多くの制限酵素は-20℃で保存されており、チューブに加える時も温度を上げないように注意されました。
しかし、最終的には37℃(酵素の至適温度)で反応させています。
制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか?失活を防ぐためですか?しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います。

また、次のような操作は可能でしょうか?
(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。
(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。

どなたか教えて下さい。お願いします。

Aベストアンサー

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には拡散しません。一次的に酵素濃度と粘性が非常に高い部分ができ、非特異的な配列を切断する可能性があります。酵素を加えてよく混和するまで冷やして、反応が起こらないようにするのがよいのです。
>(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。
これも、スター活性の原因になり、非特異的な切断がおこる可能性があります。失活を早めることにもなります。

>(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。

実際上は、いけるかもしれません。しかし、凍結してしまうと酵素は多かれ少なかれ失活するので、切断効率が起こることは覚悟しておかなければならないでしょう。

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には...続きを読む

Q酵素の比活性

 前にも似たような質問をしたのですが、よく分からないのでもう一度させていただきます。
 酵素の比活性でどのようなことが分かるのでしょうか?出来れば詳しくお願いします。

Aベストアンサー

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれば、分母は小さくなりますから、比活性は大きくなります。その大きくなり具合は、目的の酵素以外のタンパク質を取り除く操作、つまり精製操作の指標になります。完全に精製されれば、それ以上は精製しようとしても、比活性が高くならないはずです。誰かがある酵素をすでに結晶化して、そのような純粋な酵素の比活性を報告していれば、それとの比較で、自分の行っている精製操作がよいか悪いかがわかります。
とはいっても精製した酵素が一部失活すると、たとえば、半分が失活すると、タンパク質としては全部残っていますから元の値のままですが、活性は半分になったので、比活性は半分に低下します。つまり酵素の変性による失活の指標にもなります。

比活性というのは、タンパク質あたりの活性と定義されます。
今、アルコールを酸化する酵素を測定するために肝臓をすりつぶしたとします。肝臓には数千種類のタンパク質がありますが、その中でアルコールを酸化する酵素はごく一部です。他のタンパク質は全然別の酵素活性を持っていたり、酵素ではないタンパク質だったりします。ですから、タンパク質あたりの活性を計算すると、分母が大きいから、比活性は小さい値がでます。ところが精製操作を行って、アルコールを酸化する酵素以外のタンパク質が取り除かれれ...続きを読む


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