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PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。
鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり
たくさんないので、増やす事もままなりません。
他に何か良い方法があったら教えて下さい。

Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。

例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか??

A 回答 (3件)

いちばん確実でシンプルな解決策は、プライマーを変更することだと思います。

プライマーダイマーができてしまうということは、自分がデザインした2ヶのプライマーに、相補的な配列があるということです。アニールしてしまうのですから、温度や濃度などのファクターを変更しても、やはりアニールは起きてダイマーをつくりかねません。頑張っても徒労に終わる可能性があるので、相補的な部分をつくらないように、プライマー配列をデザインし直すのが早いと思います。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
実験の流れ的に、デザインを変えるのはできないんです…(T_T)
でも他に解決方法がなければ、そうした方がいいかもしれないですね。。

お礼日時:2002/07/26 20:26

こんにちは。


「ダイマーのせいで増幅されない」
「PCR条件が厳しいので増幅されない」
この二つをどうやって区別して、「ダイマーのせいだ」とおっしゃっているのですか?よろしければ教えてください。
私の印象では、条件を厳しくしたから(アニールしないために)かからないだけなのではないかと思ったのですが。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
以前に似たような実験をした時には、ダイマーもできず、泳動しても
なにもない、という状態でした。それをサザンハイブリダイゼーションで
みると、バンドが確認できました。それくらいの、少量のバンドを確認
したいと思っています。しかし今回はダイマーができているために、
本来の増幅領域は増幅されていない可能性が高い、と思いました。

アニールしないだけなら、ダイマーはできないと思ったのですが…。
確かに、条件を甘くするとかかってきます。

お礼日時:2002/08/01 13:35

こんにちは。


 わたしもNo.1さんと同じ意見です。
 そもそもプライマーを設計する段階で、ダイマーを作らないように設計するのが普通です。
「流れ的に変えられない」と言う事情がよく分かりませんけれども、当たり前の前提を無視ししたところで実験が上手くすすむとは私は思いません。プライマーを作り直すのがまず先決です。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。
一応ダイマーにならないように設計し、普通の条件では普通に増えるんですけれども、
きびしめの条件にするとダイマーが出てしまいます。
温度が高め、鋳型が少ない、という点が関係しているのでは、と思うのですが、
鋳型は増やせないんです。
流れ的に、と書きましたのは、今までは通常条件でこのプライマーで実験を進めており、
追加的な実験を行っているため、同じプライマーを使いたい、という意味です。
ヘンな書き方をしましてすいません。。
何かお知恵がありましたらよろしくお願いします。

お礼日時:2002/07/30 18:48

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※KODを用いたPCRを行う予定です。

Aベストアンサー

2本のプライマーが100%マッチでしたら、まず100%ダイマーを形成します(が、そこまでひどい例は少ないでしょう)。
逆に、ダイマー形成に寄与する塩基が少ない程ダイマーができにくくなります。

クローニングなどで、そういったプライマーを使わざるを得ない場合もありますよね^-^;
そういう時は、以下のような対処が考えられます。

(1) PCRのアニーリング温度を高めに設定
(2) その他、PCRの条件を厳し目に設定(Mg++少なめなど)
(3) テンプレートを多めに入れる
(4) DMSOを少量添加
(5) 対象がgenomicDNA/cDNAといった場合、Nested PCRで増幅対象を絞り込んでおく
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Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

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Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

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通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
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このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

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Qアガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ

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kohitsujikaiさん、こんにちは。

kohitsujikaiさんは、gel厚、緩衝液の量に気を使っておられるのでしょうか?

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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

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お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

QPCRの失敗について

PCR後電気泳動したんですが、
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そうでもないんでしょうか?

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>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん
>ですか。
もう決まった条件があるのならまずうまく行かないことはありません。ですから試薬やサンプルに問題がある可能性が大です。
ただし、ちがうPCRマシーンをつかうと条件が変わってくる可能性があるので出ない場合は再検討してみることも考えたほうがいいことがあります。同じメーカで同じモデルでも機械が違うと違うとおっしゃる方もいます。
あとうまくいった時に使用したのと同じ種類のポリメラーゼを使ってますよね。それも確認した方がいいかもしれません。逆手にとって、手元に違う種類の酵素があれば使ってみるのも手かもしれません。たまにメーカーが間違ったプライマーを送って来ることがあるという話も聞いたことがあります。本当かどうかよく分かりませんが、メーカーの人に確認してもらうというのも必要なのかもしれません。

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Aベストアンサー

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Aベストアンサー

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