アンピシリン入り寒天培地の作成

　寒天培地初心者なのですが、アンピシリンいり寒天培地を使って
大腸菌の選択をする工程で行き詰っています。

　SOBAG plateというものを作成しています。
滅菌後アンピシリン（20mg/ml)を入れて固めるのですが、何度やっても大腸菌が生えてきてしまいます。温度がさめるのを待って入れているつもりなのですが、プレート作成の確実性をあげるためにはどうしたらいいのでしょうか。
アンピシリン抜きで固めて、固まったプレート上にアンピシリンをまくという方法は邪道なのでしょうか。
本当に困っています。たすけてください。

No.7 回答者： Hayate03 回答日時： 2008/04/01 18:00

No.2です。

どこかに勘違いがありそうな気がします。先生でも学生さんでもいいので、
どなたか周りの人に見てもらうのが一番早いと思いますよ。

質問さんの作ったプレートが悪いかどうかもわかりませんから、どなたかに
使えているプレートを分けてもらって比較してみることも必要です。
（播いている大腸菌が耐性だとか、大腸菌ではないとか、そういう可能性もあります）

ご参考までに、プレートの作成方法を書いておきます。
（どこかに違いがありませんか？）
＜アンピシリン溶液の調製＞
1. アンピシリンNa 20mgを無菌の容器に計り取る。
2. 滅菌水1mlを加えて溶解する。溶かしたら冷蔵庫に入れておく。
※ -30℃で2～3ヶ月の保存が可能。

＜寒天培地の作成＞
1. 三角フラスコにSOB培地100mlを入れ、細菌培地用寒天粉末1.5gを加える。撹拌子を入れておく。
2. アルミホイルでふたをして、オートクレーブ滅菌する。
3. 撹拌しながら室温で冷ます（スターラー使用）。アンピシリン溶液を常温に戻しておく（手で温める程度で良い）。
4. 50℃程度（手で持てるくらいの温度）になったら、20mg/mlアンピシリンNa溶液を無菌的に0.5ml加える。
5. 少し撹拌し（スターラー使用）、プレート5～6枚に分注して固化させる。
※ お試し版として小スケールにしてみました。普通は500ml程度で問題なく作成できます。

No.6 回答者： nativepage 回答日時： 2008/03/31 17:59

No.4です

>低温の液体LB培地にアンピシリンを加える方法

単に液体LB培地を普通に作製、滅菌してから、十分冷却し無菌操作でアンピシリンを加えるだけです。

温度が関係ないと思うのは、ほとんどのラボではきちんと温度など測定せず、触れることができる温度になったら抗生物質を入れて上手くいっているはずだからです。

また確認なのですが、アンピシリンは最終濃度がどれくらいになるように加えていますか？

この回答への補足

「アンピシリンの濃度は20mg/mlで１Lにつき5mlいれること」と書いて　あります。
　私は作業効率が悪いせいか、寒天を調整してる間に固体化させてしまうので、100ml単位でやっています。
この書き方だと、常に100mg含有させておくのか、比例計算で含有させればいいのかわからないのです。

　昨日も、皆さんの助言通りにウォーターバスなどをつかってやりまし　たが、大腸菌が生えてきてしまいました。
　教室の先生に、「アンピシリンが悪いんじゃないのか？」と問いかけ　たところ、そんなはずがないといわれました。
　また、昨日は20mg/ml　の濃度を40mg/mlにして作ってみましたが、ま　た生えてきていました。もうどうしたらいいのでしょう・・・

補足日時：2008/04/01 12:29

No.5 回答者： ga111 回答日時： 2008/03/29 18:28

>アンピシリン抜きで固めて、固まったプレート上にアンピシリンをまくという方法は邪道なのでしょうか。

私も経験あります。これで、イキました。濃度は、たとえば１５ｍｌの寒天培地すべてに均一に拡散すると仮定して100ug/ml-250ug/ml位の高めに設定しています。（均一にならないはずなので、非常に高い濃度）いまだに、原因不明ですが、なぜなんだろう？

最初は、そのプレートの１枚に、アンプ耐性菌と感受性菌をストリークして、コントロールを取ります。

No.4 回答者： nativepage 回答日時： 2008/03/29 16:40

これに限った話ではないのですが、トラブルが生じた場合は考えられる原因をリストアップし、それぞれを別個に確認していきましょう。

今回考えられる原因は、アンピシリン耐性菌のコンタミ、アンピシリンストックの質、加えるアンピシリンの量などで、多分温度は関係ないです。

どうしても温度が気になるなら、低温の液体LB培地にアンピシリンを加え、その菌を振とう培養してみればいいと思います。
それでも増えるなら、菌の耐性かアンピシリンストックの質が原因でしょう。
アンピシリンを作り直しても駄目なら、アンピシリン耐性菌のコンタミが一番怪しくなります。

また、培養時間はどれくらいでしょうか。
あまり長く培養してしまうと、生き残りが生えてくることがあります。

この回答への補足

　温度は関係ないのでしょうか。
　この操作を正確にできないと先に進んでも意味がないので毎日何枚も　プレートを作っています。
　いれるアンピシリンの濃度は20mg/mlなのですが、キットの説明書通　りに調整しているつもりです。
　アンピシリンを新しく購入したいのですが、院生なので勝手に購入す　ることもできません。

　低温の液体LB培地にアンピシリンを加える方法をくわしく教えていた　だけたら光栄です。
　
　また、培養時間は37℃で一日です。

補足日時：2008/03/31 14:11

No.3 回答者： tunertune 回答日時： 2008/03/29 14:58

培地をさますのにウォーターバスを使っていますか？

５０度に設定してたものに３０分くらいつけておけば温度は十分下がると思います。
寒天培地初心者とのことですが、ラボの他の人はうまくいっているのでしょうか？うまくいっている人がいるのならばその人に聞くか、やっているところを見せてもらって同じようにするのが手っ取り早いを思います。

「アンピシリン耐性のものを組み込んでいないもの」とありますが、これは市販のコンピでしょうか？それともラボで増やしたものでしょうか？
まさかとは思いますが、失敗が続くようでしたらアンピシリン耐性が本当にないのかを確かめてみる必要があるかと思います。
市販品を試すとか。

この回答へのお礼

　今回からウォーターバスを使ってみます。
　抗生物質の粉末自体がこうりょくがなくなってきてるのか、
　失活させてしまっているのか、どれが原因なのかひとつずつ
　消していくしかないですね。
　助言ありがとうございました。

お礼日時：2008/03/31 14:28

No.2 回答者： Hayate03 回答日時： 2008/03/29 12:21

通常は手で持てる程度（がまん可）まで冷めていれば、まず大丈夫だと思いますが、

軍手をしてプレートに注いでいるようだと問題が有るかも知れません。

あとは、
アンピシリン溶液の濃度が間違っていませんか？
アンピシリンの添加量が間違っていませんか？
（1/1000容ですか？ちなみに私は、50mg/mlを1/1000容加えています）
ずーっと凍結保存されていたアンピシリン溶液を使ったりしていませんか？
アンピシリンの原末が古かったりしていませんか？
（まさか、アンピシリン溶液をオートクレーブしてたりはしませんよね）
アンピシリン・ナトリウムを使っていますか？
使っている大腸菌がアンピシリン耐性ではないですか？

こんなところですかね。邪道もありだと思いますが、普通のことは普通にできた方が良いですよ。

この回答への補足

　容量とかはあっていると思います。
　でも温度を正確に測るわけではなく、自分が触れる程度の温度で
　アンピシリンを投入しているので、力がなくなっているのかもしれま　せん。50℃弱でアンピシリンを入れることになっているのですが、
　それをどうやったら保てるのかいい方法はないでしょうか。

補足日時：2008/03/29 13:11

No.1 回答者： tunertune 回答日時： 2008/03/29 12:17

トランスフォーメーションのスクリーニングですか？

固まってから塗ってもいいと思いますよ。
ちなみに、私は５０度くらいでアンピシリンを投入しますがうまくいっています。

以前私の後輩が「大腸菌が生えてこない」といっていたことがあります。原因はトランスフォーメーションの時最後に希釈するＳＯＣに耐性プラスミドをもったのがコンタミしていたためでした。まくとプレートいっぱいに広がって生えるので菌が生えていないように見えたとか。
なので、アンピシリン以外の原因があるかもしれません。質問者様のまいた菌は本当にアンピシリン感受性ですか？

この回答への補足

トランスフォーメーションのスクリーニングです。
いまは、練習でアンピシリン耐性のものを組み込んでいないものをまいているので、プレートに大腸菌ははえないはずですよね。
でも、にぎやかにはえてしまいました。

返答ありがとうございます。

補足日時：2008/03/29 13:40