制限酵素で切断できなかった理由について

プラスミド５μｇをＨａｐｌｌで３７℃、１時間で完全消化したのですが、インサート内部で切断することができませんでした。原因はなんなのでしょうか？
教えていただけると幸いです。

No.2 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2008/08/31 11:49

ベクターも含め全く切れなかったのなら、酵素の失活など酵素が効かないときに普通に考えられる可能性をつぶしていけばいいですが、

>インサート内部で切断することができませんでした。
ということは、ベクターは切れたのでしょうか。
そうだとすると、
・実はインサートには認識配列がなかった
・同じ認識配列でも、酵素によっては、あるいは基質によっては切れやすいところ切れにくいところ（perferance）があることがある。たまたま非常にperfernaceが低くて切れにくかった。

大腸菌で増やしたDNAならHapII消化にメチル化の影響はないので、この可能性は排除して良いと思います。

この回答へのお礼

ありがとうございます！勉強になりました！

お礼日時：2008/08/31 16:55

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2008/08/31 09:13

実際に操作する予定だったのですね。

書かれている情報だけでは、バッファー入れたかどうかすら書かれていませんが、入れていないのであれば、まず切れないでしょう。

原因としてありえそうなのは、
１．酵素が失活していた
２．プラスミドが汚かった
３．インサート内部に制限酵素サイトが無かった
４．バッファーを入れ忘れた
５．インサートがメチル化されていた
６．ボリュームが少なく、グリセロールの影響を受けた
などがありますが、
何かこの原因の候補の中に否定できるものはありますか？

この回答へのお礼

ありがとうございます！勉強になりました！

お礼日時：2008/08/31 16:54