電気泳動の実験をおこなったのですが、環状プラスミドと直鎖状プラスミドではどうして環状の方の移動距離の方が大きいのですか?

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A 回答 (2件)

直鎖状プラスミドより先に流れるのは、スーパーコイルした環状プラスミド(sc)で、リラックス型の環状プラスミド(rl)やニックの入った環状プラスミド(op)は直線状プラスミドより遅くなります。

ただし、泳動時ゲルにエチジウムブロマイドは入ってない条件です。
どうしてそうなるかは、やってみた方が早いです。自分で納得して下さい。幅1cmほどの紙テープを長さを同じにして3本作ります。1本はそのまま(直線状)。2本目はねじらずに端と端をのり付けします(rl)。3本目はテープを何度もねじって回転させてから端と端をくっつけます(sc)。scはくちゃくちゃと崩れて一番コンパクトになっていると思います。それを同じ高さから落としてみて下さい。scは一番先に床に付きます。rlと直線状は微妙ですが、たいていrlのほうが遅くなると思います。理屈はゲル中でも(たぶん)同じです
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この回答へのお礼

とても分かりやすい例えです。大変参考になりました。ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/29 18:32

簡単に言えば、環状の方がコンパクトだから

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この回答へのお礼

なるほど、ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/29 18:30

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Qプラスミドの形態について

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。どちらの理由も説得力がありますます分からなくなりました。プラスミドは、開環状と直鎖状はどちらが早く泳動されるのでしょうか?また、直鎖状と開環状で流れる速度が逆になる境となるDNAの長さがあるのでしょうか?

頭がこんがらがりました。どなたかよろしくお願いします。

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)...続きを読む

Aベストアンサー

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナンセンスです。

>これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

ちょっと勉強すれば、それが単純化したschemeだということは了解しているので実際上全く問題ないとおもいますが。それより、実用上、実際上はプラスミドの一次構造(乗っている遺伝子の構造や向き)を示すために作図するので、トポロジーを保ったままである開環状で示すのは理にかなっています。

>プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。

もし、そんなことを言い切っている本があるなら(特に前者)、それはろくなものではありません。もうちょっといい教科書を読みましょうよ。どちらかというと後者の記述が正しいです。面積というかファンデルワールス体積ですかね。ゲルのメッシュの中を直鎖状は蛇のようにDNA分子の長軸に方向に潜り抜ける(そのため長いほどくぐりぬけるのが遅くなる)のにたいして開環状だとどの方向からでもメッシュに入りにくいので。

一般的にはcccがずば抜けて移動度が小さいというのは良いとしても(これもEtBr濃度などで変わる)、OCとlinearは微妙でかなり近いことが多いです。泳動の条件(エチジウムブロマイドの有無やその濃度、ゲル濃度)などによって逆転することもあるとされています。スタンダードな条件ではOCはlinearよりやや遅く、私が経験してきた中ではこれが逆転したことはありません。

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナ...続きを読む

Qプラスミドの電気泳動

DNAがライゲーションされたプラスミドを大腸菌から抽出して電気泳動したのですが、酵素処理をしていないにも関わらず複数のバンドが表れました。特にプラスミドの大きさを超える大きなバンドが確認されましたが、これはなぜでしょうか?

プラスミドがダイマーを形成しているからとも聞きますが、プラスミドは結合方法も含めてどのように倍数化するのですか?

又、プラスミドが何倍体になるかは決まっているのですか?ダイマーではなく、トリマーやテトラマーにはならないのでしょうか?

教えてください。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 普通にプラスミドとってくると、多少オープンサーキュラー(OC)になることがありますので、スーパーコイルしたままのものと2本のバンドが見えることはよくありますけど、それじゃないのですね?
 あと、コンカテマーとよんでますが、プラスミドの2量体ができてしまうときもあります。ひどい(というかどうか知らないが)ときには、2量体どころか3量体、4量体・・とたくさんバンドが階段状に見えます。大昔、pTZを使っていた頃はコンカテマーすごかったです。ブルースクリプトに変えてからあまり見なくなりました。
 2量体、3量体と書いてますが、繋がり方に二通りあります。二つのプラスミドが共有結合で、大きな1本のプラスミドになっているときと、鎖状につながっているときです。たぶん、鎖状です。というのは、ある配列をサブクローニングしたときのこと。あまりコンカテマーが出てひどいので、モノマーのところをゲルから回収し、それをそのまま大腸菌に入れて(つまり、ライゲーション操作してません)、プラスミドを回収したら、驚いたことに、もっとひどくなっていて、モノマーがほとんど見えなくなっていたことがあります。それで鎖状だろうと思っている次第です。
 昔確かめた限りでは、コンカテマー2量体のアガロースでの電気泳動位置は(EtBrの入ってないゲルで)、モノマーのリラックス型(トポイソメラーゼをかけて作りました。OCと同じ位置に泳動されます(EtBr無しなら))とは少しずれてましたが、だいたい同じくらいの位置に来ました。早かったのか遅かったのかはもう覚えていません。プラスミドによって異なるだろうと思いますので、一般性は分かりませんが、OC近辺に出ていたら、OCそのものか2量体です。トポかけてみると上記のように区別がつくときもあります。

 普通にプラスミドとってくると、多少オープンサーキュラー(OC)になることがありますので、スーパーコイルしたままのものと2本のバンドが見えることはよくありますけど、それじゃないのですね?
 あと、コンカテマーとよんでますが、プラスミドの2量体ができてしまうときもあります。ひどい(というかどうか知らないが)ときには、2量体どころか3量体、4量体・・とたくさんバンドが階段状に見えます。大昔、pTZを使っていた頃はコンカテマーすごかったです。ブルースクリプトに変えてからあまり見なくなりまし...続きを読む

QDNA電気泳動で困ったことが起こっています。

DNA電気泳動で困ったことが起こっています。
環状プラスミドの状態では目的バンドよりも2000bpくらい低い位置にバンドが現れるので、
おかしいおかしいと騒いでいたのですが、制限酵素処理をすると、正しい位置にバンドが現れ
ます。
これってどういう現象なのでしょうか。
経験のある方いらっしゃいますか。

ちなみに、制限酵素処理の何が影響しているのがわからなかったので、
(1)ただ単にサンプルを37℃でインキュベートしたもの、 
(2)サンプルにH-buffer(Bam/Eco用)を加え、37℃インキュベートしたもの
(3)サンプルにH-buffer,BamHI,EcoRIを加え、37℃でインキュベートしたもの
(4)TEに溶解しているDNAをインキュベート無しのもの
と、並べて泳動した結果、(3)のみバンドの位置が正しく、他は2000bp程度低かったです。
環状と鎖状の違いでしょうか。
まったく分からなくて困っています。

Aベストアンサー

非常に初歩的、常識的な現象です。
無傷のプラスミドは、スーパーコイル(supercoil)あるいはccc (covalently closed circular)と呼ばれる状態を取ります。これはプラスミド全体がぞうきんを絞り上げるようにねじれ上がって、コンパクトになっているので、同じ分子量の線形のDNAよりゲル電気泳動での移動度が大きくなります。泳動条件(バッファー組成、EtBrの有無など)やプラスミドの種類やサイズにもよりますが、移動度はおおよそ線形の倍くらいです。

cccにニック(二重鎖のある位置で、片側鎖のみ切れる)が生じると、OC (open circular)という状態になります。これは環状構造は保たれているけれど、スーパーコイルにはならず広がっています。分子の嵩が大きくなるので移動度は小さくなり、通常、同じ分子量の線形DNAよりやや遅くなります。

ウェブ検索すれば、このような解説や、泳動像の例は無数に見つかると思います。

formの異なるDNA同士では、移動度に基づいて分子量の比較はできません。
通常、分子量マーカーは線形なので線形DNAの分子量推定しかできません。
特殊な製品として、ccc プラスミドのサイズラダーなんかもあります。

非常に初歩的、常識的な現象です。
無傷のプラスミドは、スーパーコイル(supercoil)あるいはccc (covalently closed circular)と呼ばれる状態を取ります。これはプラスミド全体がぞうきんを絞り上げるようにねじれ上がって、コンパクトになっているので、同じ分子量の線形のDNAよりゲル電気泳動での移動度が大きくなります。泳動条件(バッファー組成、EtBrの有無など)やプラスミドの種類やサイズにもよりますが、移動度はおおよそ線形の倍くらいです。

cccにニック(二重鎖のある位置で、片側鎖のみ切れる)が...続きを読む

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qプラスミド

標題についてオープンサーキュラーとクローズドサーキュラーというものがあるみたいなのですが、具体的にはどういう状態のことですか。
プラスミドを環状のままアガロース電気泳動するとこの2種類がバンドとして観察されるらしいのですが、本当ですか。
お分かりの方がいらっしゃいましたら、御回答お願いします。

Aベストアンサー

>ということは、プラスミドを環状のまま制限酵素で何も切断しないまま電気泳動すると、「必ず」プラスミドの塩基数よりも(若干)低分子側に移動し、かつ移動度はクローズドサーキュラー型の方が早いということでよろしいのですよね。

同じ塩基数で比較すると移動度は
ccc>>linear>OC
です。
cccはおおざっぱにいうとlinearの倍くらい早く移動し、OCはlinearよりやや遅いです。linearの移動度とどれくらい違うかは、条件によって異なります(たとえば泳動時のEtBrの濃度など)。

泳動のとき、linear DNAは長軸方向に進み、ゲルの網目構造の間をのたくるように通り抜けると考えられています。OCがlinearより移動度が低くなるのは、OCでは分子の形に広がりがあるため通り抜けがやや遅れるためだと私は想像しています。

Qプラスミドの電気泳動で、白いもやもやしたもの

プラスミドの電気泳動をしているのですが、うまくいかずに困っています。

プラスミドは3600~5100 bp程度で、バンドは出てきているのですが、
それとは別に数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。
(マーカーの範囲外ですし、ゲルの分画範囲外です)

何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。
きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあって
なかなか原因がわかりません。

実験の条件を書きますので、このような「もやもや」や「へ」の字のバンドが出る
という症状に思い当たる方がいましたら、ご指摘お願いします。

簡単なはずの電気泳動で何度も失敗を繰り返していて、
精神的にも詰まってきています。
思いつきや些細なアドバイスなど何でも構いませんので、ぜひお願いします。


空ベクター:3600 bp
 先輩が別の実験で抽出したもので、品質は良い。

プラスミド:5100 bp程度。空ベクターにゲル切り出しで精製した1500 bpインサートを入れ、
 形質転換後ミニプレップで抽出したもの。
いずれも使用前に解凍してタッピングし、チビタンで落としています。

マーカーと空ベクターを1レーンずつ、残りのレーンに抽出したプラスミドを流しています。
ゲル:アガロース 0.8%
135 V、22 min程度

「もやもや」「へ」が出る際は、流したプラスミド全体で出る事が多いです。
逆に、マーカーや何も入っていないレーンに発生することはありません。


よろしくお願いします。

プラスミドの電気泳動をしているのですが、うまくいかずに困っています。

プラスミドは3600~5100 bp程度で、バンドは出てきているのですが、
それとは別に数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。
(マーカーの範囲外ですし、ゲルの分画範囲外です)

何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。
きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあって
なかなか原因がわかりません。

実験の条件を書きますので、このような「もやも...続きを読む

Aベストアンサー

写真ありがとうございます。
「以前はきちんと電気泳動できていたのだから、きちんと突き詰めていけば原因は必ずわかるはずだ。と指示されています。そして泳動がきちんとできるようになったら再度プラスミド抽出するよう言われています。」
質問者さんは卒論生か修士課程の方で、先輩は修士課程の方ですか?分からないからこう言っているのでしょうが、ちょっと無責任のような気がします。まあ、それは本題ではないからいいや。

「へ」の字自体はきっと泳動の条件とかによるものだと思います。50-100Vくらいにしたら真っ直ぐになるかもしれません。

“数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。”
写真からの私の印象ですが、プラスミドの精製度がそれほど良くないのかな(大腸菌由来のものが混在している)のかなと思います。高分子のバンドは、もしかしたらスーパーコイルの類いじゃないかという気もします。切らずにプラスミドそのものを流した経験があまりないので。私はいつもサブクローニングしてミニプレップした後、クローニングサイトの制限酵素で切ってインサートを確認し、ポジティブだったら大量調製して濃度と260/280比を測って実験に使っていました。質問者さんはどうして切らずに流されたのですか?インサートが入っていることは確かめられたのですか?

「空ベクター:3600 bp 先輩が別の実験で抽出したもので、品質は良い」
これは、プラスミドを切って精製したものなので大腸菌由来のDNAやRNA、タンパクの混在はないし、直鎖DNAなのでスーパーコイルとかもありません(インサートDNAもそうでしょ?)。

「何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあってなかなか原因がわかりません。簡単なはずの電気泳動で何度も失敗を繰り返していて、精神的にも詰まってきています。」
これはルーチンワークだし、質問者さんも前回までは上手くいっていたのですから、こんなところで悩まず、さっさとやり直せばいいことだと思います。グリセロールストックがあればそれから増やしなおせばいいし、なければ(今もっているサンプルがインサートの入った正しいプラスミドなら)大腸菌に形質転換しなおして調整しなおせば、それもないのでしたらサブクローニングから。同じサンプルを何回流しても単に時間の無駄ですよ。3回やっても上手くいかなかったら真剣に原因を考えればいいのに。精神的に行き詰れば行き詰るほど実験は失敗します。落ち着いて試薬も新しくして(泳動バッファーも使いまわさず)やり直してみてください。

ただ、研究室の人間関係上、どうしても今のそのサンプルで何とかしなくてはいけないというのでしたら、DNase freeのRNaseA処理をしなおしてフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿をして、プラスミドそのままと、クローニングサイトの制限酵素で切ったものとを泳動されたらどうですか?何か原因らしきものが分かるんじゃないですか。

頑張って前に進んでください。また、何かありましたら。ここに補足なりお礼なりしてもらえればチェックして答えられる範囲でお答えします。

「専門的な質問サイトもあるのでしょうか。」
私が知っているのは研究留学ネットのBioTechnicalフォーラムです。http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi
他の用途にも使えます。
http://www.kenkyuu.net/megalink.html
http://www.kenkyuu.net/javascripts.html

写真ありがとうございます。
「以前はきちんと電気泳動できていたのだから、きちんと突き詰めていけば原因は必ずわかるはずだ。と指示されています。そして泳動がきちんとできるようになったら再度プラスミド抽出するよう言われています。」
質問者さんは卒論生か修士課程の方で、先輩は修士課程の方ですか?分からないからこう言っているのでしょうが、ちょっと無責任のような気がします。まあ、それは本題ではないからいいや。

「へ」の字自体はきっと泳動の条件とかによるものだと思います。50-100Vくらいにし...続きを読む

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Qプラスミドの制限酵素処理

プラスミドを作る時、制限酵素で切断しますよね。切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、ライゲーションするわけですが、セルフクローニングがたくさん出てしまい、なかなかうまくいきません。
2種類の酵素で処理(切断部位が近接(数~数十bp))していて、脱リン酸化処理はしていません。2カ所で切断されていれば、脱リン酸化にかかわらず、セルフライゲーションは起こらないはずだと思うので。
だとすると、どちらか一方の酵素でしか切断されていないものが多いことが原因だと思います。1カ所切断と2カ所切断のサイズが同じぐらいであるため、分離するのは難しいと思うのですが、何かよい方法、アドバイスはありませんでしょうか?

Aベストアンサー

サブクロしていて一度はみんな経験するトラブルですね。
こんなとき、理屈をいろいろ難しく挙げられる人もいるのですが、
質問者さんも百も承知であると思われるので、
私はこれまで、こういうトラブルを乗り切って
後から考えるとうまくいかなかった理由はこうではないかという
実体験を書かせていただきます。

私の場合、こういうときに脱リン酸化処理が
劇的に問題解決に結びついたことはあまりないいんですよね。

一度、ベクターを2つの制限酵素でカットしてゲル切り出しするときに
面倒だったので、大量のDNAを1レーンに泳動して切り出して、
最後に切り出して抽出したDNAを泳動して確認したときなんですが
ちゃんと切り出したにも関わらず、切れていないベクターと思われる
バンドが確認されたことがあるんです。
このとき、勝手な想像で、
カットされたベクターが多量にありすぎて、
カットされていないベクターを引っ掛けて(巻き込んで)
泳動されたのかなぁと思い、1レーンあたりのDNAを減らすために
1レーンで流した量を10レーンに分けて泳動して回収したところ
1レーンに多量のときとほぼ同じ量が回収でき
かつ、切れ残りと思われるバンドも見えなくなりました。
なんでこうなったか理論はよくわかりませんが、
私の中では迷信かもしれないけど難しい理論より経験が大事だと思った
次第であります。

もし心当たりがおありでしたらお試しあれ。

また、理屈よりもクローンを取ることが大事だと思うので、
どなたかが書かれていましたが、時には力技も必要かもしれません。
私も重要度にもよりますが何度か四の五の言わずにやりました。

サブクロしていて一度はみんな経験するトラブルですね。
こんなとき、理屈をいろいろ難しく挙げられる人もいるのですが、
質問者さんも百も承知であると思われるので、
私はこれまで、こういうトラブルを乗り切って
後から考えるとうまくいかなかった理由はこうではないかという
実体験を書かせていただきます。

私の場合、こういうときに脱リン酸化処理が
劇的に問題解決に結びついたことはあまりないいんですよね。

一度、ベクターを2つの制限酵素でカットしてゲル切り出しするときに
面倒だった...続きを読む

Q電気泳動の原理について

今大学で電気泳動を盛んにしているのですが、いまさらながら電気泳動の原理や、なぜしているのかなどがいまいちよくわかりません・・・バンドがでてきますが、何を表しているのかもいまいちです。。情けない限りなのですが、どなたか教えていただけるとありがたいです。染色体地図をかいてくるとういう課題もでているのですが、電気泳動の意味がよくわかっていない自分には手のつけようのない課題なのです。どうかお願いします。

Aベストアンサー

DNAの電気泳動の目的は簡単に言うと、さまざまな大きさの断片をその大きさによって分離することです。
すなわち、泳動後に現れるバンドは、大きさのまとまった断片の集まりということになります。

まず、DNAは核酸という酸であるということはご存知のことと思います。
酸は水溶液中でマイナスに帯電します。
つまり、電気を流すとプラスの方へ流れていくことになります。
DNAを流すゲルは肉眼では見えないほど細かい網目構造となっているので、より小さな断片ほどその網目構造を素早く縫って移動できます。
これは、よりプラス極の近くに現れるバンドほど小さな断片であることを意味します。

以上のことをまとめるとどうでしょう?電気泳動の全体像が見えてきませんか?


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