電気泳動の実験をおこなったのですが、環状プラスミドと直鎖状プラスミドではどうして環状の方の移動距離の方が大きいのですか?

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A 回答 (2件)

直鎖状プラスミドより先に流れるのは、スーパーコイルした環状プラスミド(sc)で、リラックス型の環状プラスミド(rl)やニックの入った環状プラスミド(op)は直線状プラスミドより遅くなります。

ただし、泳動時ゲルにエチジウムブロマイドは入ってない条件です。
どうしてそうなるかは、やってみた方が早いです。自分で納得して下さい。幅1cmほどの紙テープを長さを同じにして3本作ります。1本はそのまま(直線状)。2本目はねじらずに端と端をのり付けします(rl)。3本目はテープを何度もねじって回転させてから端と端をくっつけます(sc)。scはくちゃくちゃと崩れて一番コンパクトになっていると思います。それを同じ高さから落としてみて下さい。scは一番先に床に付きます。rlと直線状は微妙ですが、たいていrlのほうが遅くなると思います。理屈はゲル中でも(たぶん)同じです
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この回答へのお礼

とても分かりやすい例えです。大変参考になりました。ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/29 18:32

簡単に言えば、環状の方がコンパクトだから

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この回答へのお礼

なるほど、ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/29 18:30

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Qプラスミドの単離(アルカリ法)

プラスミドをアルカリ法で単離するのにLysozymeとEDTAを使いました。
これらの役割を教えてください><

Aベストアンサー

Lysozyme
細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素。大腸菌の細胞壁を壊す働きを持つ。

EDTA
陽イオンと結合するキレート剤。DNA分解酵素はその活性化に陽イオンが必要であるため、EDTAによって陽イオンを奪うことでDNA分解酵素を不活性化する。

ネットや参考書にもたくさんの詳しい解説が簡単に見つかると思いますよ。

Q直鎖状DNAだと環状に比べて形質転換の効率はどうなりますか?

今まで、環状のプラスミドDNAで形質転換を行っていましたが、
制限酵素で切断処理(切断部位は一つ)で処理したものを使ってみると
ぜんぜん上手くいきません。

物理的な大きさ増すことで形質転換効率は恐らく低下すると思うのですが、
実際にはどの位変化するものなのでしょうか?
(もちろん形質転換法によって違いはあるとは思いますけれど・・・)

今まで一回も成功した事がないのですが、いくらなんでも、
直鎖状だと形質転換できないなんて事はないですよね。

ま、腕もかなり悪いので、、、、(^^;)

Aベストアンサー

了解しました。

バチルスは扱ったことがありませんのでなんともいえません。

既にご存知かも知れませんが、バチルス形質転換に関することがかかれた書籍が引っかかりました。参考になりますか?

参考URL:http://www.bcasj.or.jp/jssp/f_biochem/kumikae_dna.html

Qアルカリ法について

・アルカリ法でIII液を加えた後、転倒混和していますが、某本では「ボルテックスで混和する」とありました。
・アルカリ法の原理から考えれば、別に激しく攪拌しても問題ない、どころか、攪拌した方がプラスミドの回収率が良いと思われます。
・そこで質問ですが、III液を加えた後、攪拌してはいけない理由、或いは攪拌しても良い理由を、どなたか教えて下さい。
・今までは、攪拌したらゲノムがコンタミするのだろうと漠然と考えていましたが、そういうものではないのでしょうか。

Aベストアンサー

ANo.1、2です

>筆者は、本の随所で度々原理・理論を謳っていることから、ゲノムの
>コンタミについて、気付いてないとは思えないんですよ。従って、
>敢えて(?)攪拌している理由が、やはりあると思われるんですよね。

おっしゃるとおり、敢えて攪拌している理由はあると思います。
バイオ実験イラストレイテッドという本は、分子生物学実験初心者が失敗せずに実験ができることに重きを置いて書かれていると認識しています。
III液による中和が完全でないと、その後の遠心で上清と沈殿をうまく分けることができませんから、これは完全な失敗になりますよね?ゲノムDNAが多少コンタミしてでもプラスミドが回収できることを重視すれば、ボルテックスなり激しく振るといった処理の仕方になるのではないかと思います。

>写真のスメアが薄いのは例えば、攪拌によりゲノムが断片化しても、
>ほとんどは数10Kb以上の大きさで、且つ一本鎖であるため、
>フラックスに取り込まれている事実を反映しているんじゃないでしょうか。

スメアの濃淡、プラスミドDNAバンドの濃淡は、最終的にDNAのペレットを何μLの水に溶解させるかによります。件の写真は、おそらくColE1 oriの高コピープラスミドを取り、やや多目の水に溶解させていると思われます。ゲノムDNA<<プラスミドですので、スメアが薄く見えるのではないかと・・・。
質問者様がやろうとしているのはBACとのことですから、これは多くて数コピー、モノによっては1コピーです。高コピープラスミドとまったく同じ菌体量・手法で取ったとなると、ほぼ同じ量のゲノムDNAに対してプラスミドは1/1000程度しかありません。これは相対的にゲノムDNAのコンタミ量が増加することを意味します。

従って、高コピープラスミドならば、III液添加後ボルテックスでも激しい攪拌でもそれほど問題ないが、低コピーおよび超低コピープラスミドに関しては穏やかにしっかり混合するほうがよい、というのが回答になるのかなと思います。いかがでしょうか?

ANo.1、2です

>筆者は、本の随所で度々原理・理論を謳っていることから、ゲノムの
>コンタミについて、気付いてないとは思えないんですよ。従って、
>敢えて(?)攪拌している理由が、やはりあると思われるんですよね。

おっしゃるとおり、敢えて攪拌している理由はあると思います。
バイオ実験イラストレイテッドという本は、分子生物学実験初心者が失敗せずに実験ができることに重きを置いて書かれていると認識しています。
III液による中和が完全でないと、その後の遠心で上清と沈殿をうまく分ける...続きを読む

Qプラスミドの電気泳動で、白いもやもやしたもの

プラスミドの電気泳動をしているのですが、うまくいかずに困っています。

プラスミドは3600~5100 bp程度で、バンドは出てきているのですが、
それとは別に数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。
(マーカーの範囲外ですし、ゲルの分画範囲外です)

何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。
きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあって
なかなか原因がわかりません。

実験の条件を書きますので、このような「もやもや」や「へ」の字のバンドが出る
という症状に思い当たる方がいましたら、ご指摘お願いします。

簡単なはずの電気泳動で何度も失敗を繰り返していて、
精神的にも詰まってきています。
思いつきや些細なアドバイスなど何でも構いませんので、ぜひお願いします。


空ベクター:3600 bp
 先輩が別の実験で抽出したもので、品質は良い。

プラスミド:5100 bp程度。空ベクターにゲル切り出しで精製した1500 bpインサートを入れ、
 形質転換後ミニプレップで抽出したもの。
いずれも使用前に解凍してタッピングし、チビタンで落としています。

マーカーと空ベクターを1レーンずつ、残りのレーンに抽出したプラスミドを流しています。
ゲル:アガロース 0.8%
135 V、22 min程度

「もやもや」「へ」が出る際は、流したプラスミド全体で出る事が多いです。
逆に、マーカーや何も入っていないレーンに発生することはありません。


よろしくお願いします。

プラスミドの電気泳動をしているのですが、うまくいかずに困っています。

プラスミドは3600~5100 bp程度で、バンドは出てきているのですが、
それとは別に数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。
(マーカーの範囲外ですし、ゲルの分画範囲外です)

何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。
きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあって
なかなか原因がわかりません。

実験の条件を書きますので、このような「もやも...続きを読む

Aベストアンサー

写真ありがとうございます。
「以前はきちんと電気泳動できていたのだから、きちんと突き詰めていけば原因は必ずわかるはずだ。と指示されています。そして泳動がきちんとできるようになったら再度プラスミド抽出するよう言われています。」
質問者さんは卒論生か修士課程の方で、先輩は修士課程の方ですか?分からないからこう言っているのでしょうが、ちょっと無責任のような気がします。まあ、それは本題ではないからいいや。

「へ」の字自体はきっと泳動の条件とかによるものだと思います。50-100Vくらいにしたら真っ直ぐになるかもしれません。

“数万bpの位置に白くもやもやしたものが出たり、「へ」の字のバンドが出たりします。”
写真からの私の印象ですが、プラスミドの精製度がそれほど良くないのかな(大腸菌由来のものが混在している)のかなと思います。高分子のバンドは、もしかしたらスーパーコイルの類いじゃないかという気もします。切らずにプラスミドそのものを流した経験があまりないので。私はいつもサブクローニングしてミニプレップした後、クローニングサイトの制限酵素で切ってインサートを確認し、ポジティブだったら大量調製して濃度と260/280比を測って実験に使っていました。質問者さんはどうして切らずに流されたのですか?インサートが入っていることは確かめられたのですか?

「空ベクター:3600 bp 先輩が別の実験で抽出したもので、品質は良い」
これは、プラスミドを切って精製したものなので大腸菌由来のDNAやRNA、タンパクの混在はないし、直鎖DNAなのでスーパーコイルとかもありません(インサートDNAもそうでしょ?)。

「何度も同じサンプルを流しても、出たり出なかったりと不安定です。きっと私の腕が悪いからなのでしょうが、結果が安定しないだけあってなかなか原因がわかりません。簡単なはずの電気泳動で何度も失敗を繰り返していて、精神的にも詰まってきています。」
これはルーチンワークだし、質問者さんも前回までは上手くいっていたのですから、こんなところで悩まず、さっさとやり直せばいいことだと思います。グリセロールストックがあればそれから増やしなおせばいいし、なければ(今もっているサンプルがインサートの入った正しいプラスミドなら)大腸菌に形質転換しなおして調整しなおせば、それもないのでしたらサブクローニングから。同じサンプルを何回流しても単に時間の無駄ですよ。3回やっても上手くいかなかったら真剣に原因を考えればいいのに。精神的に行き詰れば行き詰るほど実験は失敗します。落ち着いて試薬も新しくして(泳動バッファーも使いまわさず)やり直してみてください。

ただ、研究室の人間関係上、どうしても今のそのサンプルで何とかしなくてはいけないというのでしたら、DNase freeのRNaseA処理をしなおしてフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿をして、プラスミドそのままと、クローニングサイトの制限酵素で切ったものとを泳動されたらどうですか?何か原因らしきものが分かるんじゃないですか。

頑張って前に進んでください。また、何かありましたら。ここに補足なりお礼なりしてもらえればチェックして答えられる範囲でお答えします。

「専門的な質問サイトもあるのでしょうか。」
私が知っているのは研究留学ネットのBioTechnicalフォーラムです。http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi
他の用途にも使えます。
http://www.kenkyuu.net/megalink.html
http://www.kenkyuu.net/javascripts.html

写真ありがとうございます。
「以前はきちんと電気泳動できていたのだから、きちんと突き詰めていけば原因は必ずわかるはずだ。と指示されています。そして泳動がきちんとできるようになったら再度プラスミド抽出するよう言われています。」
質問者さんは卒論生か修士課程の方で、先輩は修士課程の方ですか?分からないからこう言っているのでしょうが、ちょっと無責任のような気がします。まあ、それは本題ではないからいいや。

「へ」の字自体はきっと泳動の条件とかによるものだと思います。50-100Vくらいにし...続きを読む

Qアルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度

アルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度

こんにちは。早速質問です。

大腸菌を培養し、シーケンスのためにMini prepでプラスミドの抽出を行いました。
(マニュアルです)

その後、TEに溶解し、吸光度計を用いて、DNAの濃度と純度を測定したところ、A260/A280=1.1
とかなり純度が悪くなってしまいました。(kitと比較してです。kitでは2.0ぐらいになります)
その後、エタ沈をしてもなぜか純度は全く改善されず、A260/A280=1.1のままでした。

どのような操作に注意したらよいのでしょうか?
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ミニプレップ産物の制限酵素処理にRNase処理を組み合わせたときに、
泳動先端にRNAの分解産物が見えますか?

一般的なミニプレップキットだと、大腸菌を回収して
resuspendするバッファーにRNaseが入っていると思うのですが、
マニュアル法だとRNaseを省略している人がいる気がします。

RNaseがなければ、当然最終産物にRNAがコンタミしますので、
純度は悪くなります。

最初のバッファーにちょろっとRNase入れるだけなので、
試してみたらいかがでしょうか。

QプラスミドDNAを電気泳動する時と吸光度測定した時との濃度差について。

土壌に含まれる微生物を特定する研究をしており、PCRを行うために細菌よりプラスミドDNAを取り出し、取れたか確認のために電気泳動を行いました。
ゲルは、1%のアガロースゲルを用い、ゲル作成時に使用した溶液と電気泳動の際のバッファー溶液は1×TAEを使用しました。

1ヶ月ほど前にプラスミドDNAを抽出し、電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色、紫外線を当て観察すると、23000bp付近にバンドが確認出来ました。
このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの量は650μg/mlでした。

ところが最近、前回と同じ操作でDNA抽出をしたのですが、今回の場合、電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色をし、紫外線を当て観察すると、前回よりもバンドの蛍光は強くなっていました。
しかし、このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの濃度は200μg/mlまで低くなっていました。

なぜ、このように電気泳動をした時の蛍光が強くなったにもかかわらず、DNAの濃度は下がってしまったのでしょうか?
マーカーの蛍光は、前回と同じように見えました。

また、このサンプルを用いてPCR操作を行う事は出来るのでしょうか?

本を調べ、アルカリや酸で加水分解されると核酸はモノヌクレオチドになり、260nmの吸光度は高分子核酸に比べて10~15%増加するという事は分かったのですが、これが決定的な原因では無いと思います。

原因の予想がつく方がいらっしゃるなら、教えていただけると幸いです。

土壌に含まれる微生物を特定する研究をしており、PCRを行うために細菌よりプラスミドDNAを取り出し、取れたか確認のために電気泳動を行いました。
ゲルは、1%のアガロースゲルを用い、ゲル作成時に使用した溶液と電気泳動の際のバッファー溶液は1×TAEを使用しました。

1ヶ月ほど前にプラスミドDNAを抽出し、電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色、紫外線を当て観察すると、23000bp付近にバンドが確認出来ました。
このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの量は650μg/mlでした。

ところが...続きを読む

Aベストアンサー

御自分で調べられているように、プラスミドDNAは、閉環状、開環状、直鎖状の形を取りますので、それにより濃度があてにならないと指導教官からアドバイスを貰ったことがあります。
詳しく調べていないので分かりませんが、吸光度測定での濃度と、ラダーとの光り方から推測する濃度が一致しないのもそのためだと思っていました。

また、他の方も回答なさっているように、純度の問題・機器の問題もあると思います。

なので、私は濃度だけで言えばどちらかと言えば、電気泳動から推測される濃度の方をあてにしています。
ラダーとサンプルのアプライ量とバンドの輝き方から推測出来ますので、今後はそちらも見てみてはどうかと思います。

PCRについては、純度の問題もありますが大丈夫だと思います。
私は、クローニングの際にコンピテントセルからプラスミドDNAを抽出しています。
電気泳動の結果と、吸光度測定での濃度に差があるときでも十分使用できています。ただ、DNAのtemplate量が考えにくいだけで…。

RNase処理とプラスミドDNAの構造の関係は、申し訳ありませんがわかりません。

御自分で調べられているように、プラスミドDNAは、閉環状、開環状、直鎖状の形を取りますので、それにより濃度があてにならないと指導教官からアドバイスを貰ったことがあります。
詳しく調べていないので分かりませんが、吸光度測定での濃度と、ラダーとの光り方から推測する濃度が一致しないのもそのためだと思っていました。

また、他の方も回答なさっているように、純度の問題・機器の問題もあると思います。

なので、私は濃度だけで言えばどちらかと言えば、電気泳動から推測される濃度の方をあてにし...続きを読む

QアルカリSDS法におけるDNAとプラスミドの分離について

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか?
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか?原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね?一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか?
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか?何かのタンパクを介しているのでしょうか?
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか?EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか?
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね?

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、...続きを読む

Aベストアンサー

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、そ...続きを読む

Qプラスミドの電気泳動

DNAがライゲーションされたプラスミドを大腸菌から抽出して電気泳動したのですが、酵素処理をしていないにも関わらず複数のバンドが表れました。特にプラスミドの大きさを超える大きなバンドが確認されましたが、これはなぜでしょうか?

プラスミドがダイマーを形成しているからとも聞きますが、プラスミドは結合方法も含めてどのように倍数化するのですか?

又、プラスミドが何倍体になるかは決まっているのですか?ダイマーではなく、トリマーやテトラマーにはならないのでしょうか?

教えてください。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 普通にプラスミドとってくると、多少オープンサーキュラー(OC)になることがありますので、スーパーコイルしたままのものと2本のバンドが見えることはよくありますけど、それじゃないのですね?
 あと、コンカテマーとよんでますが、プラスミドの2量体ができてしまうときもあります。ひどい(というかどうか知らないが)ときには、2量体どころか3量体、4量体・・とたくさんバンドが階段状に見えます。大昔、pTZを使っていた頃はコンカテマーすごかったです。ブルースクリプトに変えてからあまり見なくなりました。
 2量体、3量体と書いてますが、繋がり方に二通りあります。二つのプラスミドが共有結合で、大きな1本のプラスミドになっているときと、鎖状につながっているときです。たぶん、鎖状です。というのは、ある配列をサブクローニングしたときのこと。あまりコンカテマーが出てひどいので、モノマーのところをゲルから回収し、それをそのまま大腸菌に入れて(つまり、ライゲーション操作してません)、プラスミドを回収したら、驚いたことに、もっとひどくなっていて、モノマーがほとんど見えなくなっていたことがあります。それで鎖状だろうと思っている次第です。
 昔確かめた限りでは、コンカテマー2量体のアガロースでの電気泳動位置は(EtBrの入ってないゲルで)、モノマーのリラックス型(トポイソメラーゼをかけて作りました。OCと同じ位置に泳動されます(EtBr無しなら))とは少しずれてましたが、だいたい同じくらいの位置に来ました。早かったのか遅かったのかはもう覚えていません。プラスミドによって異なるだろうと思いますので、一般性は分かりませんが、OC近辺に出ていたら、OCそのものか2量体です。トポかけてみると上記のように区別がつくときもあります。

 普通にプラスミドとってくると、多少オープンサーキュラー(OC)になることがありますので、スーパーコイルしたままのものと2本のバンドが見えることはよくありますけど、それじゃないのですね?
 あと、コンカテマーとよんでますが、プラスミドの2量体ができてしまうときもあります。ひどい(というかどうか知らないが)ときには、2量体どころか3量体、4量体・・とたくさんバンドが階段状に見えます。大昔、pTZを使っていた頃はコンカテマーすごかったです。ブルースクリプトに変えてからあまり見なくなりまし...続きを読む

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q電気泳動 生物の実験

電気泳動の際の、ゲルの染色液がほんの少量1.2滴ほど、はねて洋服についてしまった可能性があります。
この際は服はもう処分してしまったほうが良いのでしょうか?
洗濯して再び使用するのは危ないですか?

Aベストアンサー

使った染色液の名前はなんですか?
何を電気泳動しましたか?(DNA・RNAか、タンパク質か)

実験の時の先生にどうすればいいのか聞くのが一番確実ですよ。

タンパク質のSDS-PAGEならば、染色液は、濃い青色のCBBでしょうか?
それでしたら人体に無害なので洗濯して着られますが、色が落ちないかもしれません。
ゲルの染色後、脱色液(酢酸の水溶液)にエタノールを10%くらい入れると色の抜けが良くなるので、服にエタノールをちょっとつけてトントンすると落ちるかも?
ジーパンとかだったらそのままで平気ですね。

核酸のアガロースゲル電気泳動だと、使った染色液はエチジウムブロマイド(エチブロ)が入っているかもしれないので、ちょっと心配です。発がん性物質なので…あ、でも皮膚にちょっと触れるくらいなら新陳代謝ですぐどっかいっちゃうから心配ない、と私の先生が言ってましたので、そんなに不安にならないでね。
紫外線をあてるとオレンジに光るやつだったら、エチブロかもしれないです。(違う可能性もあります。GelRedという、エチブロと同じ使い方で発がん性が低い試薬があります。)
でも、手袋着用でその部分だけ洗ってしまえば平気な気がします。
環境のことを考えると、実験室の流しでやったほうがいいかな?研究室によっては、エチブロを捨てる時に活性炭に吸着させたりする必要があるところもあるようなので、先生に聞いてみてください。

あとは、黒く染まったなら銀染色かも。
銀染色はやったことがないのでよく知らないのですが、銀は重金属だし、ほかにも有機溶媒とかを使うみたいなので、そのまま洗うと環境に良くないかもしれません。

使った染色液の名前はなんですか?
何を電気泳動しましたか?(DNA・RNAか、タンパク質か)

実験の時の先生にどうすればいいのか聞くのが一番確実ですよ。

タンパク質のSDS-PAGEならば、染色液は、濃い青色のCBBでしょうか?
それでしたら人体に無害なので洗濯して着られますが、色が落ちないかもしれません。
ゲルの染色後、脱色液(酢酸の水溶液)にエタノールを10%くらい入れると色の抜けが良くなるので、服にエタノールをちょっとつけてトントンすると落ちるかも?
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