プラスミドのコンストラクションについてです。初めて質問させていただく修

プラスミドのコンストラクションについてです。初めて質問させていただく修士学生で、半年近くうまくいかず、修論が書けないような状態です。研究室の構成上、先輩はおらず、先生も同じ操作を行ってもうまくいきません。
目的とするプラスミドが作成できません。Kpn1とXho1サイトを付加した3.2 kbの配列をpGEM T EASYベクターにTAクローニングし、pGL4.10または3 Basicにサブクローニングを行っていますが、トランスフォーメーション後、コロニーは生え、使用ベクターより高いプラスミドが得られるのですが、PCRおよび制限酵素処理の結果から目的としているものではありません。
具体的に、ベクターとインサートをKpn1とXho1で処理後、ベクターはホスファターゼ処理を、インサートはpGEMが3.0 kbでありインサートと近いことからカラム精製を行いSca1でpGEM部分を消化後、両者ともゲル精製を行い、エタ沈後インサート200 ng、ベクター50 ngでMightymixでライゲーションを行い、トランスフォーメーションを行っています。精製キットはWizard SV Gel purification Kitを使用しています。またライゲーション前の濃度測定の他、電気泳動によりインサートとベクターが切断されていることおよび目的の分子量であることは確認している上、切り出しのUVは長波長を用い、最小限の時間で行っています。
全てのキットや酵素は新品に変えました。また結果として、コロニーは30-100(場合によりまちまち)、ネガティブは多くても10程度生え(生えないか生えても3個ほどが多い)、30-100生えたコロニーはMiniprepの結果uncutと、目的のものが入ったかと思われたものの2パターンありますが、制限酵素でインサートが切れません。制限酵素処理の組成は多くためしましたが全く切れません。またベクターの両端からのPCRの結果からも、目的産物が入っているとは考えにくいです。何かが誤って入ったにしろ制限酵素で切れるはずと思うのですが切れない上、ゲル精製を行っていることからも他のものが入ることはないような気がします。ベクターのMCSとインサートの配列はダイレクトシークエンシングで確認済みです。この不可解な結果は何度も再現性がとれております。何がどうなっているのか全くわかりません。外注を考えなければいけないのかと思うくらいです。コンピはJM109を使用しています。上記全ての試薬類は全て新品および正常に機能することを確認してあります。もう頼るところがここしかなく、神に祈る気持ちで質問させていただいたほどの心境です。どなたか答えていただけたら、心から幸いです。

No.9 ベストアンサー 回答者： negigi 回答日時： 2010/07/21 19:31

#7です。

切断に関してはしっかり確認されているみたいなので、切れ残りというのは考えにくいかもしれないですね。ただ、KpnIは低塩濃度下で切断するため、この3つの酵素の中では1番最初に処理した方がよいです。

ScaIに関しては、こちらの勘違いでした。確かにベクターの2kb程度のところにあるようですね。

あとは、#8の方がおっしゃられるようにスター活性で意図しない切れ方をしているか、AP処理が強すぎて末端が削れてるか、AP処理後のフェノクロが不適切でLigationに持ち込んでるか、といったところでしょうか。

この回答へのお礼

度々ありがとうございます。
Kpn1の適切なバッファーの特性までは確認していませんでした。pGEMからインサートの切り出しはゲルのバンドで見ているので問題ありませんが、ベクターは断片を確認できませんので、バンドが一本となることでしか確認しておらず、もしかするとXho1とKpn1を同時に入れたことによる切断不足も十分に考えられます。これについては本日より、ベクターの切断検討を行っておりますので(ダブルダイジェスト後、そのままトランスフォーメーション、またはライゲーション後トランスフォーメーション、さらにCIAP処理+ライゲーション後トランスフォーメーションという検討)、その結果からわかると思います。
APにより、そのような可能性が出てくるとは考えておりませんでした。実はAP後、フェノクロ処理は行っておらず、ゲル精製、エタ沈のみ(またはエタ沈は行わない場合もありました)しか行っていませんでしたので、それが原因かもしれません。ただ、その際はAPによるリガーゼ阻害？によりライゲーション自体が起こらないのでしょうか。そうであればコロニーは生えてこないのでしょうか。もしそうであればコロニーは生えてきますので、スター活性、または上述の理由となるでしょうか。ともかくベクターについての検討を行ってみます。
見ず知らずの私のために、このように親切に何度も回答をくださったこと、とても感謝しております。あとは回答をくださった皆様の親切を無駄にしないためにも、実験がうまきいくことを望むばかりです。本当にありがとうございます。

お礼日時：2010/07/22 00:37

No.8 回答者： guragura77 回答日時： 2010/07/20 23:30

きっちり切断しようとし過ぎて酵素を入れ過ぎたり、DNA が少なかったりでスター活性がでてるだけなんじゃないですか？

本来の認識配列以外が切れているからライゲーション後に再切断できない、切断部位が変わったためにプライマー配列が切り離されてしまって PCR できない、という状況に思えますが。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
その可能性はあると思います。ただ、ライゲーション前にバンドを確認し、短くなっていないか、もしくは長くなっていないかは確認しております(とは言っても0.8％ゲルなので、1-400bp程度のズレは見過ごしてるかも知れません)。ただ、たまたまインサートでスター活性が出てしまった場合、それがたまたまスター活性が出たベクターとライゲーションされる可能性はスター活性が出ていないものより低くなるような気がしているのですが、私は知識と経験不足でわかりません。入ったと思われるものは全て切れなかったこと、および得られたプラスミドのうち1/2程度がこの意味がわからないプラスミドということから、単にスター活性のみでは説明できない気がしています。すみません、おそらく私の状況の説明不足でした。しかし、たまたまスター活性の出やすい配列がインサートと同じくらいのbpという可能性は否定できないため、その側面も視野に入れるべきと考えます。回答くださり、ありがとうございます。

お礼日時：2010/07/21 00:53

No.7 回答者： negigi 回答日時： 2010/07/20 13:40

> コンパチとはなんでしょうか？

Compatible endのことです
KpnIとXhoIとでは末端の形が異なるため、脱リン酸化しなくてもくっつくことは稀です。にも関わらず、ネガティブ(だと考えられる)コロニーができているため、脱リン酸化処理無しでライゲーションを行い、酵素が両方とも完全消化されているか確認する必要があると考えました。

同時に、もし制限酵素処理に問題があるとすれば、insertの切り出しもうまくいっていない可能性があり、ScaI処理前に電気泳動するべきだ、と回答しました。

> ダブルダイジェスト及びシングルダイジェスト
メーカーの指定通りにやっています。NEBにしろタカラにしろ、DDでの推奨バッファーはサイトに記載してあります。あとは、Unit数を一々計算するのでなく、反応量の1/10まで酵素を加えて(DDの場合は1/20ずつ)、オーバーナイトで完全消化させています。

> エタ沈後の溶液はミリQ またはTEで問題はないのでしょうか
基本的には問題ないと思います。しかし、TEに含まれるEDTAがLigationを阻害する可能性はあります。Ligaseの説明書に、その旨の記載がないか確認してください。

> エタ沈を行わなくてもゲル精製後、その溶出液で直接クローニングを行ってもよいのでしょうか
kitによります。kitの説明書に直接クローニングしてもよい、と書いてあるのなら、直接やっても問題ありません

> プラスミドのコンストラクションでよく問題となるのはどういった点が多いのでしょうか
コンストラクトによって様々です。試薬、手技、塩基配列・・・挙げていけばきりがありませんが、1つずつ消化するほかありません

1つ気になっているのですが、pGEM-T easyベクターにはScaIサイトがないようですが、pGEM-Tベクターと勘違いしていませんか？本題とは違うので、答える必要はありませんが。

この回答へのお礼

ありがとうございます。多くを教えていただき、非常に勉強になりました。先輩もおらず、何かを聞ける人がいないも同然なので助かります。
切断の確認ですが、まずインサートをSca1で処理後、バンドが一本(form1？)となることを確認しています。インサートはその後カラム精製を行います(バッファー交換)。次にXho1でインサートおよびベクターを消化後、またバンドを確認し、Kpn1により切断し、また確認しています(見えるか見えないかくらいの切れ残りがある場合はKpn1処理時に0.5マイクロのXho1を追加しています)。さらに、ライゲーション前にもバンドがインサート3.0kb、ベクター4.5kb付近なのをマーカーで確認し、ライゲーションを行っています。
回答していただき、必要だと感じたのは、ネガティブとしてライゲーションを行わず、酵素処理のみのベクターを生やしてみるということです。ありがとうございます。やってみます。
pGEM TおよびT easy両者にMCS以外の部分にSca1部位が存在することは説明書で確認しております。インサートの3.0kb内に認識部位がないことも確認しております。
お忙しい中、多くを教えていただき、本当にありがとうございます。

お礼日時：2010/07/21 00:21

No.6 回答者： overthisgraysky 回答日時： 2010/07/20 06:15

博士課程の者です。

ScaIの処理が不完全で元のベクターが紛れ込んでたりしないでしょうか？
参考までに私の研究室のやり方なら、
Insertは、それぞれ”ATAT-制限酵素配列－目的の遺伝子配列”といった構成のプライマー（５’側と３’側）を使ってPCRで合成し（50ul）、カラム精製、KpnIとXhoIで切断（NEBならBuffer1で同時に）、ゲル泳動してゲル精製したものを直接ライゲーションに使います。
Vectorは、質問者さんの書いたとおり、KpnIとXhoIで切断し、ホスファターゼ処理（KpnIとXhoIサイトはまずくっつかないので理論的にはしなくても可）し、ゲル泳動、ゲル精製して、これもそのままライゲーションに使います。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
Sca1処理後、電気泳動で切断は確認しております。それでも紛れ込んでいる可能性は考えましたが、そうだとしても、もともとinsurtの両端に含まれているKpn1、Xho1サイトがあるはずですので（でなければligationが行われないはずですので）、目的としたplasmidができていなくとも（違うものが入ってしまったとしても）、vectorのuncut以外はminiprep後、Kpn1、Xho1で切り出せるはずだと考えています。
方法について詳しく教えていただいてありがとうございます。実は私の手技が悪いのだと考えており、方法について非常に不安がありました。しかしこのように教えていただけることで、方法の段組みは間違っていなかったのだとわかり、他の可能性に当たることができます。皆様、本当に私のためにご丁寧な回答をくださって、誠にありがとうございます。

お礼日時：2010/07/20 10:29

No.5 回答者： cpbr 回答日時： 2010/07/20 03:05

まずPCRの方ですが、PCRでcDNAの５‘にプロモーター・シークエンスを３’にターミネーター・シークエンスを付加してしまうというものです。

これらのシークエンスを含んだ長めのプライマーを使うことになります。
キットも売られているようです（わたしはこのキットを使ったことはありません）。
http://www.genlantis.com/commerce/staticwebpage. …
原著論文はこれだったと思います。
http://www.jbc.org/content/277/5/3593.abstract
この方法の欠点はPCRプロダクトはサイズが大きくなるにつれてトランスフェクション効率が劇的に悪くなることです（この点に関しては改良が進んでいるかもしれません）。
次にフラグメントの精製ですが、ゲル精製の場合にUVでフラグメントが傷んでしまった可能性はないでしょうか。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
そのような方法があるのですね。勉強になります。
確かに仰るとおり、TAクローニングの失敗についてはUVによる損傷が考えられます（以前はUVで損傷するという知識を持ち合わせていなかったので）。しかし現行のサブクローニングは、長波長（302 nm）で行っており、また時間的には30 sec以上は照射していません。これでも多いのでしょうか。
皆様の回答を基に、一番考えられる原因は制限酵素処理が不完全ということ、またはUVによる損傷が原因ということし、再度下記の条件で実験を行ってみようと思います。
→overhang（制限酵素サイト+3-6塩基）を付加したprimerでPCRを行う。
→PCR productをカラム精製する。
→できる限りDNAが低濃度の系で、PCR prooductとvectorを制限酵素処理（何本か行い、最後にまとめる）を行、vectorをBAP or CIAP処理する。
→ゲル生成は行わず、カラム精製のみ行い、ligationする。
上記により、未切断のものが減り、またUVによる損傷も無いと思います。切断部分はカラム精製（20 bp程度はカラムに吸着し辛いと聞いているので）で覗けます。大きな問題は、それでも残ってしまった未切断産物です。これは生えてきてしまいますが、生えてきた全コロニーを突っつけば、一つくらいは入ってくれるのではないかと思います。非効率的かもしれませんが・・・。
一つ気になるのは、UVによる損傷を受けた場合、ligationが行われにくくなるのか、それともtransformationが行われにくくなるのでしょうか。私はtransformationがされないか、transformationはされるがその損傷プラスミドを含む菌体は増殖しないと考えているのですが・・・。
度々誠にありがとうございます。

お礼日時：2010/07/20 10:20

No.4 回答者： cpbr 回答日時： 2010/07/20 00:23

プラスミドのコンストラクションで最も難しいのはインサートが大腸菌の嫌いな蛋白質をコードしてしまっているときです。

ウイルスの蛋白のときにみられることが多いような気がしますが、そういうときは何をやってもうまく行きません。
実験の目的によっては、PCRだけでコンストラクトを作ってしまうという手もあります。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
その話は聞いたことがあります。それはタンパク誘導剤による発現で軽減可能と聞き、それ専用のベクターを用いています。
二番目のお話は初めて聞きました。もう少しそれについてのお話を伺えないでしょうか？
それとPCRで思い出したのですが、インサートに使用するためpGEMに3.0kbと1.8kbをTAクローニングさせたときの話ですが、はじめの投稿で記載したゲル精製キットを使用して、切り出したものをTAクローニングさせた際、目的の物が得られなかった経緯があります(とは言っても、100程生えたコロニーのうち、24突っついただけで、全てでクローニングされていなかったかはわかりませんが)。同時にゲル精製による切り出しを行わず、PCR後すぐにカラム精製を行う方法でもクローニングを行っていたので、これを突っついたらうまくいったのでこれをインサートに使用することにしたのです(24のうち3ほど入っていました)。たまたま失敗したのだと思い、ゲル精製はまだ手技が安定していないからだと思っていたのですが、今考えるとこのことから、私の使っているゲル精製キットがクローニングに不向き(説明書には使用可と書いてありますが)という可能性はあるのでしょうか。言い換えますと、ただのカラム精製より、ゲル精製を行ったら方がライゲーション効率が落ちることがあるのでしょうか。お忙しい中、何度も質問してしまった上、更に質問してしまい大変申し訳ございません。

お礼日時：2010/07/20 01:06

No.3 回答者： negigi 回答日時： 2010/07/19 11:21

ざっと読んだ感じですと、XhoIとKpnIのどちらかで完全消化できていない気がします。

経験上、コンパチでない2つの制限酵素で切断した場合、BAP処理をしなくてもネガティブクローンはほとんど出ないはずです。試薬は新しいようですので、もしかしたら配列の関係でうまく処理できていないか、ダブルダイジェストで使うバッファーを間違えているかもしれません。

基本的な解決は#2の回答者さんがおしゃるように、制限酵素を変えればよいと思いますが、どこまでも原因を突き止めたいのであれば、以下の方法を試してみるのもよいかもしれません。

1) insertをKpnIとXhoIで切ったサンプルで電気泳動する
2) insertをScaI処理と未処理に分ける
3) vectorもBAP処理と未処理に分ける
4) 以下の組合せでLigationを行う
　a) insert(ScaI処理) ＋ vector (BAP処理)
　b) insert(ScaI処理) ＋ vector (BAP未処理)
　c) insert(ScaI未処理) ＋ vector (BAP処理)
　d) insert(ScaI未処理) ＋ vector (BAP未処理)
　e) vector (BAP処理)のみ

この回答へのお礼

ありがとうございます。
ダイジェストのバッファーは、酵素会社のネットサービスおよびカタログで確認しております。また、コンパチとはなんでしょうか？すいません、勉強不足です。
おっしゃってくださった実験により、確かに違いが見られればどこがおかしいかわかるかもしれません。
１つは皆様にうかがいたいと思っていたのは、具体的にダブルダイジェスト及びシングルダイジェストでうまくいった際はどのように行っているのでしょうか。他の研究室や過去の先輩方(多くはありませんが)のプロトコルを見たのですが、どなたも千差万別のような感じがしています。また、エタ沈後の溶液はミリQまたはTEで問題はないのでしょうか。さらに、エタ沈を行わなくてもゲル精製後、その溶出液で直接クローニングを行ってもよいのでしょうか。エタ沈は、カラム精製後ですと濃縮のために行うわけで、むしろ純度がカラム精製後より下がるような気がしていたのです。勉強不足で大変申し訳ございません。先輩もいなく、学生二人の研究室で非常に困っています。また、プラスミドのコンストラクションでよく問題となるのはどういった点が多いのでしょうか。質問が多すぎて大変申し訳ないので、お答えいただける部分だけ教えていただけたなら幸いです。

お礼日時：2010/07/19 22:59

No.2 回答者： cpbr 回答日時： 2010/07/19 03:19

何が起こっているのかを知るのに役には立ちませんが、制限酵素サイトを変えて（別の制限酵素サイトを付加して）サブクローニングをやってみてはいかがでしょうか。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
実はKpn1のみによるpGEMへのクローニングも行っており、Kpn1によるシングルダイジェストによるサブクローニングも行いました。結果としてうまくいきませんでした。また他の実験でpET-15bに、pGEMにNde1とBamH1サイトを付加した1.8kbをクローニングたものを切り出してサブクローニングしているのですが、そちらも同じようにうまくいきません。こちらもコロニーが同じように生え、これをシグマのキットでミニプレップを行っても回収ができません(回収量がほぼゼロに近い)。こちらは以前先生が違うものを挿入した際には苦労はしたがうまくいったと言っています。なので私がただ単にクローニングが下手なのだと思っていて、先生が先日投稿させていただいたものと上記の両方ねコンストラクションを行いましたが、両方とも私と同じ結果となってしまいました。なので制限酵素を変更しても同じかもしれません。しかし、せっかくおっしゃってくださったので、試してみようと思います。ありがとうございます。

お礼日時：2010/07/19 22:49

No.1 回答者： cpbr 回答日時： 2010/07/18 12:54

「ベクターのMCSとインサートの配列はダイレクトシークエンシングで確認済みです」とありますが、インサートは目的のものではなかったということでしょうか。

付加したはずのKpn1とXho1サイトはありましたか？

この回答へのお礼

早速の回答、誠にありがとうございます。切羽詰まっていたので本当に嬉しいです。
ダイレクトシークエンシングは挿入前のベクターのMCSとPGEMにクローニングしたインサートの配列を確認したということであり、ライゲーション後のプラスミドの配列は読めない状態です。これもなぜだかわかりません。ただライゲーション後のプラスミドは制限酵素で全く切れないので(この制限酵素は新品で、切断効率も確認済みです)、目的のものが入っていないと考えます。ライゲーション前にベクターとインサートが切断されているのは電気泳動の結果から明らかですので、仮に違うものが入ったとしても切断されるはずなのですが…。本当に何がなんだかわかりません。ゲル精製キットが悪いのでしょうか。しかし説明書にはクローニングに使用できると書いてあります。曖昧ですみません。

お礼日時：2010/07/18 16:16