前回の質問の続きで申し訳ないのですが、再びPCRのことで質問です。

前回の質問の続きで申し訳ないのですが、再びPCRのことで質問です。
http://oshiete.goo.ne.jp/qa/6295149.html

条件を再検討しまず組成を変更しました。

組成
forwardプライマー：3μL（=3pmol/μL）
reverseプライマー：3μL（=3pmol/μL）
10xThermoPol Buffer：5μL
dNTP：6.25μL(final濃度で250μM)
vent DNA polymerase：0.5μL
鋳型DNA：0.5μL
formamide:1μL
滅菌水：31.05μL
計50μL

反応
・反応
96℃：5分
↓
25サイクル
96℃：1分
55℃：1分
72℃：1分
↓
72℃：5分
↓
4℃：

設計ではPCR産物の長さは約100塩基です。また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。
また、プライマーは今回2種類使用しています。

結果は添付した画像のとおりスメアとなってしまいました。今現在、dNTPを増やしたり、polymeraseの量を減らしたりということを考えていますが、原因や改良点あればご指摘お願いします。

添付したファイルは
左から通常時2レーン、ホットスタートしたもの2レーン、ホットスタートし40サイクルまわしたもの2レーンとなっています。
一つのDNAから、2種類のプライマーを使い、PCRを行うので、2レーンごとです。
両サイドは100bp Ladderマーカーです。一番下のバンドが100bpです。設計なら、このあたりに出ます。

No.3 ベストアンサー 回答者： negigi 回答日時： 2010/11/13 01:24

Stepdownが必要なターゲットに出会ったことが無いので、なんともいえないです。

Tmを上げたということは、新しいプライマーを設計したということでいいんですよね。それでもうまくいかないとなると、ターゲットか試薬に問題があるようにも思います。

また、#2の方も聞いてますが、プライマーに制限酵素配列とか入れてたりしますか？当然ですが、相同出ない配列が入っている場合は、アニール温度は理論値よりも下がりますよ

あと、再度聞きますが、ポリメラーゼのトラブルシューティングについては確かめましたか？
ターゲットの純度や、GC含有率については問題ないですか？

No.2 回答者： larme001 回答日時： 2010/11/08 04:13

とりあえず、PCRの溶液組成やホットスタートなどの問題ではないように思います。

以前から使っていて今回だけおかしいのであれば酵素などの条件はプロトコルどおりにするべきでしょう。

さて、増え方が変と言いますがそもそも目的はなんなのですか？発現量を比較したいのではないようなのでplasmidにサブクローニングするのが目的なのでしょうか？それなら普通はサイクル数は最大で問題ないと思います。また、目的の位置にバンドがある程度あれば切り出してシーケンスで問題なければOKなはずですがそれも違うのでしょうか？見た感じ、いずれの条件でも目的位置に全くバンドが出ていないことからもprimerの問題か、鋳型DNAの問題としか思えません。

どうしてもその細胞？から増やす必要があるなら、primerを変えてみるとかでしょう。非特異的な増幅を減らしたかったらTmを65～70ぐらいにしてもいいと思います。もし、制限酵素サイトなどを末端に入れたり塩基置換があるならステップアップPCRとかもいいかもしれません。サイズも30bps程度まで長いほうがいいと思います。

自分だったら、、、ですが、そもそも全く目的の位置にいない時点で「根本的に増えていない」と考えますね。結局はPCRで「何がしたいのか」によって方法が変わるのですが、100bpsで増幅で制限酵素というならpromoterの増幅かなにかでしょうか？同一細胞にこだわらなければ、同種の別の細胞からDNA自体を取ってくるとか、増幅する位置を少し変えるとか、それこそ100bps程度なら内部にくっつきやすい配列があるようには思えないので、別の増幅primerでnested pcrを試すとかでしょうか。とりあえず、Tm-5℃ってのもあくまで参考なので、ためしにTm(=60℃）まで上げてみますか。

PCRの方法論が最終目的でないなら、一般的な改善方法を試してうまくいかないなら少しやり方を変えるのも手かと思います。

No.1 回答者： negigi 回答日時： 2010/11/08 00:59

前回の質問に答えたときは、プライマーを変えればマシになるかと思ってたんですが、ここまでとは・・・。

とりあえず、

酵素の説明書にあるTrouble Shootingに、非特異のバンドが多い場合について書いてあると思うのですが、すべて試しましたか？

目的配列のGC含有率はどれくらいでしょうか。あまりにGC richであれば、いろいろ検討する必要があります。

テンプレートDNAはきれいですか？テンプレートの純度が気になります。きちんときれいに抽出できていますか？

プライマーが2組ということは、ForwardとReverseが2種類ずつあるんですよね。組合わせは4通りですが、全部試さないのですか？

あと、もっとTm値を上げたほうがいいですよ。自分はシングルバンドを出したいときは、アニール温度が60～62℃になるようにプライマーを設計しています。

うまくいかないなら、前回の回答で出てきたnested PCRや、stepdown PCRという方法もあります。調べてみてください。

最終手段として、「目的の産物もできている」と考えて、100bpあたりをゲル切りして抽出し、それをテンプレートにPCRする方法もあります。あくまで、どうしてもうまくいかないときの最終手段として。

とりあえず、こんなとこでしょうか。

この回答への補足

返信ありがとうございます。
Tmを5℃上げて実験してみたところバンドは確認できましたが、やはりスメアになってしまいました。
stepdownPCRを試してみたいのですが、
これは
96℃5分
↓
5サイクル
96℃1分
72℃1分
↓
5サイクル
96℃1分
70℃1分
↓

といった具合でよろしいのでしょうか？
最後のサイクルはかなり多いようですが、これは大体何度までやればいいでしょうか？
また、バンドをきれいに出したいときはこの温度の刻み幅は少ない方がいいでしょうか？

補足日時：2010/11/09 22:19