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No.1
- 回答日時:
要するにGSHかなんかのビーズで精製してきたものを一部流したらバンドが複数みられ、また、目的のものと思われるもののバンドの位置が少しおかしいということでしょうか?理由はいくつか考えられますが、サイズが多少前後するならたまにみられる(翻訳後修飾の有無とか)し、GSTがN末なら、とりあえずC末端付近を認識できる(できれば)、そのタンパク質の抗体とかでブロットして認識される断片がどれかとか確認してみるのがいいのではないですか?(もちろんCBBの量の1/10~1/100ぐらい希釈してね)。
不要な成分という真意はともかく、大腸菌から目的のタンパク質を”精製”したいわけですからそれ以外のゴミがGSHビーズにくっついてくることは十分考えられますよね。だから、結合後のWash等をもう少しきちんとやるとか、場合によってはwash bufferの組成を変えるて、多少ロスがあっても純度を重視したりするとか考えればよいわけです。まあ、CBBのみ認識されるバンドが目的のものよりもがっつりいるとかなら問題かと思いますが、どんなに頑張っても5ugとかがっつり流せば多少はゴミは入るとおもいますよ。結晶化とかに使うならそれこそ、HPCLとか次なる方法で精製するでしょうし、要するに次の目的に対してどの程度純度が必要かどうかを踏まえてかんがえれば、100%必ずしもpureでなければいけないというものではないです。ただ、活性が無いとか、他の人がやってるのに比べて明らかにおかしいとかなら少し手順を再検討する必要があるとはおもいますけど。いずれにしても、非変性条件(温度、バッファー、プロテアーゼ阻害等)で行っており、すでに報告されている論文とかで問題なく取っているような場合はよっぽど特殊な方法を使わないかぎりタンパク質が壊れて断片化してブロードいっきになるなんてことは無い気もしますけど、不安なら手順をその先輩に確認すればいいのではないでしょうか?まあ、まずはウエスタンできるならすぐにやってみてバンドが認識されるかを確認するのがいいと思います。
まああとは、大腸菌で翻訳しにくい場所があったりするとその場所で止まったりするので、そういう断片が極端に増えやすくなる場合もあります。良く誘導後にGSTの位置にバンドが見えるのもそういうものの一種でしょう。その場合は大腸菌を変えたりするのが早いと思います。
この回答へのお礼
お礼日時:2012/02/06 21:59
とてもわかりやすいご説明をありがとうございます。
そうなのですね、目的の蛋白質も発現はされているのですが、それ以外のバンドも目立ったもので。
発現の条件の検討も行って、まずウエスタンをやってみたいと思います。
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