血球版での細胞数の計測。均等に散らばりません。

ビルケルチュルク血球版を使って癌細胞の細胞数をカウントしているのですが、うまく細胞が均等に散らばりません。顕微鏡で見ますと、細胞が偏っている事が多々あります。
工程としましては、
細胞懸濁液10μlをカバーガラスと血球板にの間に流し込み顕微鏡で見てカウントするという方法なのですが、
何か良い解決方法は無いでしょうか。
倍ぐらい細胞数が違う区画が多々あります。

ご教授お願い致します。

No.5 回答者： otx 回答日時： 2013/02/24 21:41

あまりこういう書き込みは好ましくないのですか、しょうがないです・・・。

血球計算板は、最初にカバーガラスを被せ、カバーガラスの両サイドに
「ニュートンリング」ができるようにします。

そうすることで、中に入れる溶液の厚みが、顕微鏡で細胞数を数えるために
適正なものになるからです。

最近は、カバーガラスを上からクリップで止めるタイプや
カバーガラス的なものが既にかぶさった使い捨ての計算板もあるくらいです。
http://www.arb-ls.com/products/c_chip/

参考までに
http://rinsh.blog118.fc2.com/blog-entry-6.html

計算板に流し込む溶液は、通常何かしらの溶液で希釈することがほとんどなので、
中に入れるのが困難なほど粘性が高いことのほうが、聞いたことがありません。

勢いよく入れるというのは、ためらい無くいれた方が
均等になりやすいという、経験的なものです。

No.4 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/02/24 14:24

補足です。

粘度が高い等の理由で血球計算盤の隙間に細胞液が流れにくい場合、
細胞液を入れてからカバーガラスを乗せます。

勢い良く入れるのは聞いたことがありません。
サイドからキムワイプ等で液を吸うのと同様、細胞数を誤認する可能性があります。

No.3 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2013/02/24 12:09

トリプシンが効いているかいないかは、

顕微鏡でカウントするときに、細胞がくっついているかどうかでわかるので
細胞がバラバラになっているにもかかわらず、均等でないとおいことで回答します。

1,血球板がガラス製ならば、一度よく洗ってみる。

たまに汚いと、液自体がうまく広がらない時があります。

2,細胞液を流し込む時、思い切って流し込む

勢いよくし過ぎると問題ですが、躊躇するのもよくないです。

３，そもそも細胞の大きさが大きめ。

他の細胞でも同じようなのでしょうか？一度比較してみては？

参考までに。

この回答へのお礼

最終的にやはりうまくいきませんでした。
今度は血球板を変えてみようと思います。
みなさん回答ありがとうございました。

お礼日時：2013/03/25 19:20

No.2 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/02/22 21:15

キチンとトリプシン処理ができていればピペッティングでバラけるはずです。

恐らくトリプシンの効きが悪いのではないでしょうか？

良くあるケースとしては次のようなことが考えられます。
操作と試薬を見直してみて下さい。

・培地除去が不十分
・トリプシン処理の前のリンスにPBS(-)ではなく、間違えてMg/Ca++が入っているものを使っている
・トリプシンの活性が落ちている

参考になれば幸いです^-^

No.1 回答者： yukinek00 回答日時： 2013/02/22 19:42

細胞懸濁液を流し込む以前に、指で優しくタッピング（癌細胞なので優しくピペッティングでも大丈夫かもしれませんが）してよく拡散させていますか？

細胞懸濁液自体の濃度の偏りが反映されているのかもしれません。

この回答への補足

十分にピペッティングしてから流し込んでいますが、うまくいきません。

補足日時：2013/02/22 19:50