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分光光度計でダブルビームで測定する理由は何なのでしょうか。

以前、日本分光社製の紫外可視分光光度計(ダブルビーム)を使用していました。
例えば、色素のクロロホルム溶液の吸光度を測定する手順は
(1)まず、参照セルとサンプルセルにそれぞれクロロホルムを入れてベースライン測定をします。
(2)次に、サンプルセルの中身を色素のクロロホルム溶液に換えてサンプル測定をする
という流れでした。

しかし、初めから参照セルが空、(というよりセルすら無し)で、サンプルセルのみで(1)ベースライン測定、(2)サンプル測定を行っても同じスペクトルが得られました。

日本分光のHPを見ると、
http://www.jasco.co.jp/jpn/technique/internet-se …
ダブルビームだと経時での光源のふらつきを補正できるらしいのですが、、、

結局は(2)のサンプル測定で記録したスペクトルから(1)のベースライン測定で記録したスペクトルを差し引いているのですよね?
そうしますと、結局は経時で光源の光量は変化しますので(1)のベースライン測定から時間がたてばたつほど(2)のサンプル測定時の吸光度は正しい値からずれるので、ダブルビームでもシングルビームも同じだと思うのですが。
それとも、(2)のサンプル測定時に、(1)のベースラインを差し引いた上でさらに、参照セル側との差を補正しているのでしょうか。そうすると、上で述べました参照セル無しの場合でも、有りの場合と同じスペクトルが得られるはずは無いのですが。

詳しい方いらっしゃいましたら、教えて下さい。

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A 回答 (3件)

ダブルビーム方式では、参照セル側の検出器で常に光源の光量をモニタしながら測定している、と考えるといいです。



I_sam_2 = サンプル測定時に試料セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I0_sam_2 = サンプル測定時に試料セルに照射された光の強さ

とすれば、試料セルの透過率は定義により

(式1) 試料セルの透過率=I_sam_2/I0_sam_2

となります。しかし、これではセルそのものや溶媒の透過率を一緒に測っていることになりますので、通常はサンプル測定に先立ち、ベースライン測定を行います。

I_sam_1 = ベースライン測定時に試料セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I0_sam_1 = ベースライン測定時に試料セルに照射された光の強さ

とすれば、試料の透過率は

(式2)  試料の透過率=(I_sam_2/I0_sam_2)/(I_sam_1/I0_sam_1)=(I_sam_2/I_sam_1)/(I0_sam_2/I0_sam_1)

となります。I_sam_2とI_sam_1は検出器の出力から分かります。I0_sam_2/I0_sam_1をどう評価するかが、シングルビーム方式とダブルビーム方式で大きく異なる点です。

シングルビーム方式では、I0のドリフトが小さいものと仮定し、I0_sam_2=I0_sam_1として試料の透過率を求めます。

(式3)  シングルビーム方式の透過率=I_sam_2/I_sam_1

つまり、ベースライン測定時とサンプル測定時で、I0が変わらないものとして透過率を算出しています。

一方、ダブルビーム方式では、参照セルを用意して、参照セル側の検出器でI0のドリフトをモニタします。

I_ref_2 = サンプル測定時に参照セル側の検出器に入ってきた光の強さ
I_ref_1 = ベースライン測定時に参照セル側の検出器に入ってきた光の強さ

ここで、I0_sam_2/I0_sam_1=I_ref_2/I_ref_1と仮定すれば、試料の透過率は

(式4)  ダブルビーム方式の透過率=(I_sam_2/I_sam_1)/(I_ref_2/I_ref_1)

となります。仮に入射光I0がドリフトしてI0_sam_2>I0_sam_1となったとしたら、透過光強度I_sam_2が大きく測定されます。しかしビームスプリッターで分けられた参照セル側のI0も同時に大きくなるので、透過光強度I_ref_2も大きくなり、比をとることで相殺されます。これがダブルビーム方式のドリフト補正のしくみです。

> 初めから参照セルが空、(というよりセルすら無し)で、サンプルセルのみで(1)ベースライン測定、(2)サンプル測定を行っても同じスペクトルが得られました。

I_ref_2とI_ref_1の絶対値は参照セルの有り無しで大きく変わりますが、I_ref_2/I_ref_1は参照セルの有り無しでほとんど変わりません。ですので、参照セル無しの場合でも、有りの場合と同じスペクトルが得られます。
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この回答へのお礼

回答ありがとうございました m(_ _)m

ご丁寧で詳しい説明をありがとうございます!

おかげ様で長年の疑問が完全に氷解しました。ありがとうございました。

お礼日時:2013/03/04 23:22

ダブルビームの本質的な意味は,光源の揺らぎの問題です.


ランプの明るさというのは,ずっと見てると結構明るくなったり暗くなったりを繰り返しているのです.
この明るさの変動を無視できる範囲であれば,ブランクとサンプルの2回の測定を行って演算処理を行えばいいのです.
しかし,単純に透過光量の測定を2回やると,どうしても光源の光量揺らぎとかが発生し,それによるノイズ,不確かさがかぶってきます.
この問題は同じ光源の光を二つに分け,つねに同一の条件でブランクと試料を測って比較することで,原理的に小さくできます.
時分割の危険が,とくに高感度測定では致命的になるので,今でもダブルビームという光学系に意味があるのです.
しかしこれは各波長での吸光度が基準に対してどうなっているかはわかりません.
そこで,個々の測定はダブルビームで,共通基準に対して測定して,光源の時間変動の問題を含まない,ブランクとサンプルのデータを別々に得た上で,さらにその吸光度の差分を取ってブランクを補正することで,正確さの高い測定をするわけです.
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この回答へのお礼

回答ありがとうございました m(_ _)m

お礼日時:2013/03/04 23:23

>初めから参照セルが空、(というよりセルすら無し)で、サンプルセルのみで(1)ベースライン測定、(2)サンプル測定を行っても同じスペクトルが得られました。


無意味。

 ダブルビームの利点は、ブランクの補正をしなくても済むこと。
1) 同一波長でも長時間測定すると、光量が変わるなど、状態が変化する可能性がある。ダブルは、ブランクもサンプルも同様に変わるので、補正の必要が無い。
2) 吸収スペクトルをとるときに、波長ごとにセロ補正をしないでも済む
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この回答へのお礼

回答ありがとうございました m(_ _)m

無意味というのは、ベースライン測定(ブランクの補正)自体がいらないということなのでしょうか。。。

お礼日時:2013/03/04 23:20

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Q分光光度計での測定手順

分光光度計である溶液の濃度を測定しています。
人によって二つのやり方があることが分かり、どちらが正しいかを検討しています。
ちなみにダブルビームです。
(方法1)
・キュベットAとBに水を入れてゼロ補正
・次にキュベットAにブランク、キュベットBにサンプルを入れて吸光度の差を測定する。
(方法2)
・キュベットAに水、キュベットBにブランクを入れてゼロ補正
・次にキュベットAに水、キュベットBにサンプルを入れて測定。
・ブランクとサンプルのそれぞれの吸光度の差を計算する。

どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。どなたか教えてください。

Aベストアンサー

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

1.ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
  いつものキュベットで普通の水溶液で吸光度測定をする限り(有機溶媒
  系で測定とかでなく)、試料Aを測定するにも試料Bを測定するにも、
  いつも0Absの基準は同じものにするのが望ましいです。そのためには、
  "常に同じ"蒸留水同士で取るのがベターと考えます。

2.ダブルビームの分光光度計は基本的に、サンプル溶液とブランク溶液
  の比をリアルタイムで測定することを前提に設計しています。
  (きっとどのメーカーも)

ただし、これは作る側の立場で考えていることなので、使う側の方が
「こちらの方が理屈でも経験上でも良い結果が出る」ということであれば、
決してそれを否定するものではありません。
特に、分光光度計の設計者の多くは物理屋であり、使う方々の多くはきっと
化学屋さんである点は要注意かも知れません。

以前、分光光度計の設計をやっていました(早い話、作る方のプロでした)。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと(方法1)ですね(ひょっとして私だけだったらごめんなさい)。

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  つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
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Q吸光度計にて 石英セルとガラスセル

抽出したゲノムDNAの濃度測定にて、吸光度計を使用して吸光度を調べる実験を最近行いました。そのとき抽出して希釈したDNAを石英セルに入れたのですが、そこで先生から
「石英セル以外にガラスセルやプラスチックセルもあるのになんで石英セルを使うの?」
という質問をされ、
「屈折率の問題で石英セルが一番適しているからです。」
と答えたのですが、
「それはプラスチックだけ。なんの不純物も入ってないガラスセルなら屈折率なんて問題にならないよね?じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?」
と言われ、そこでまったく答えらませんでした。調べたところ、ガラスより石英のほうが高価だから精密度がいい?といったものが出たのですが・・・違うようです。
なぜ、ここでは石英セルを使用するのですか?教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく、石英セルでないと・・・」です。
 http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html
 石英セルは、可視部も紫外部も通します。ガラスセルでは、可視部は通すが、紫外部はほとんど通さないようです。ですから、石英セルで可視部を測るのは測定上は適正なのですが、破損の可能性を考えて(石英セルは1個1万円、ガラスセルは3000円ほどでした)、可視部はガラスセル使用というのが現実的です。
 当時は、石英セルには、セルの上部にスリガラスの線が入っているものが石英セルでした。今は違うようですが。

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参考URL:http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

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Q吸光光度法の検量線について

検量線を作成し、データーにばらつきが生じた場合はどのようにすべきなんでしょうか。無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが・・回答をお願いします。

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 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

 正確にするために検量線を2連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、2連より10連、100連の方が正確、と毒づいています)。
 
 実験のテクニックが難しくて、全体がばらつく場合もあります。この場合は、5点ではなく、10点とか、測定する回数を増やしたりして、信頼性を高めるしかありません。検量線は、もちろんパソコンで引きます。また、サンプルの測定も、一回だけではなく、数回測定して、平均値を去る必要があります。

 化学反応は、バラツキマセン。しかし、生物のサンプルは、個体差があるので、最低3回は測定して、平均と標準偏差を示します。例えば、血糖値を測定するときに、血液中のグルコースの測定は、ばらつかないので1回で十分。しかし、A、B、Cサンそれぞれの値は異なるので、ヒトの血糖値となると、最低3人は測定しなければなりません。
 同じサンプルを測定して、値がばらつくのは単に腕が悪いだけです。学生だと5%程度、慣れると2%以内、分析のプロだと0.5%の誤差でもウルサク言います。
データがばらつく原因を考え、検量線とサンプルの測定回数を決めてください。

>無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが
測定した点をつないだりしているのでしょうか。それはヤリマセン。昔は、測定した点の近くをなるべく通る直線(場合によっては曲線)を、慣れを頼りに引いていました。今ではパソコンがあるので、回帰式を出します。これが検量線になります。最近は、機器に検量線を自動的に描き、濃度まで計算しているのが、普通です。
 回帰式の相関係数が、0.98以上あれば信頼していますが、0.95だとやり直すかどうか迷います。

 検量線を引くための標準液は、0を含めて、6点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを5点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。4点の場合もあります。
 基本は、グラフを書いて、1点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。2点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

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Q波長(nm)をエネルギー(ev)に変換する式は?

波長(nm)をエネルギー(ev)に変換する式を知っていたら是非とも教えて欲しいのですが。
どうぞよろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

No1 の回答の式より
 E = hc/λ[J]
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となります。
波長が nm 単位なら E = hc×10^9/eλ です。
あとは、
 h = 6.626*10^-34[J・s]
 e = 1.602*10^-19[C]
 c = 2.998*10^8[m/s]
などの値より、
 E≒1240/λ[eV]
となります。

>例えば540nmでは2.33eVになると論文には書いてあるのですが
>合っているのでしょうか?
λに 540[nm] を代入すると
 E = 1240/540 = 2.30[eV]
でちょっとずれてます。
式はあっているはずです。

Q分光光度計・吸光度とは?

ある液体の濃度測定をお願いしたところ、「分光光度計にて595nmにおける吸光度を測定する」と言われました。僕にはさっぱり意味が分からず、結果の数値を見ても人に説明できません。で、分光光度計とは?吸光度とは何でしょうか?何を測定したのでしょうか?まったくの無知なもので、よろしくお願いします。

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 分光光度計とは、光源から出た光を波長ごとに分ける部分(分光部)と、分けた光を試料に当てて光の弱くなる程度を測定する部分(光度計)からなります。
 試料に当てる光の強さをXとし、試料を通過した後の光の強さをYとすると、
 まず、透過率を求めます。透過率・・・T(%)=X/Y×100
 もっとも、普通に光度計で則って居する場合、純水などをいれた空セルで100%合わせをして、次にセル内を試料に入れ替えて測定するので、透過率は装置に表示され、計算する必要はありません。
 次に、この透過率から吸光度を求めます。
 吸光度=-log(T/100)
 なぜ吸光度を計算するかと言うと、溶液中の光を吸収する成分の濃度が吸光度と比例するからです。
 予め濃度の分かった標準試料を用いて、濃度と吸光度の関係を求めて「検量線」を作っておき、その他試料の吸光度を測定する事で濃度が求められます。

 測定する色調により波長は変わります。
 検量線作成に先立って、標準試料の場合の吸収スペクトル(広い波長範囲にわたり、波長と光の吸収度の関係をグラフ化したもの)を採り、測定上最適な波長を決めます。
 普通は、光の吸収の一番大きい波長を選びますが、その他条件も加味して決定する必要は有ります。
 595nmは可視光線のやや長目の波長です。

 なお、#2さんの提示されている「Lanbert-Beerの法則」(ランバート・ベールのほうそく)は基本的かつ重要で有名な法則です。

 P.S 吸光度の計算例
 透過率=85.3%だとすると、
 吸光度=-log(85.3/100)=0.069
 (昨今の分光光度計は吸光度も自動表示されるので、いちいち計算する必要は無いのですが、原理を知っている事は大切です)
 
 

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 まず、透過率を求めます。透過率・・・T(%)=X/Y×100
 もっとも、普通に光度計で則って居する場合、純水などをいれた空セルで100%合わせをして、次にセル内を試料に入れ替えて測定するので、透過率は装置に表示され、計算する必要はありません。
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Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
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では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

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データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
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Q蛍光スペクトル

蛍光スペクトルと励起スペクトルについて教えてください

励起光の波長を変化させて蛍光の波長を固定して測定したものが励起スペクトルで、励起光を固定して蛍光の波長を測定したものが蛍光スペクトルだというのはわかるのですが、2つがどういうものかということがよくわかりません。

教科書のスペクトルと見ると、横軸は波数で蛍光の波長だと、わかるのですが、励起光の波長はどこに表されているのでしょうか?

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あまり難しい言葉や数式は使わずわかりやすく回答してもらえれば幸いです。

Aベストアンサー

#1さんの説明の通りですが、いくらか、図などがあった方がわかりやすいかもしれませんので、参考URLにgoogleで出て来たページを紹介します。ページ中程にあるJablonski Diagramの左側が蛍光について示した物です。以下、おそらく溶液の蛍光についての質問であると予想して、述べます。

さて、蛍光の過程について述べますと、蛍光とは図にある青の矢印に対応する励起光を分子が吸収します。その後、図では黒色の矢印で示された光を発しない緩和過程(溶媒などに熱エネルギー等の形でエネルギーを渡し、エネルギーの低い状態へ移動する)を経て励起状態振動基底状態へ移動します。そして、図では緑の矢印で示されている蛍光が発光します。

質問者様のおっしゃる励起スペクトルはこの青色の矢印の波長を変えながら緑色の矢印すべてひっくるめた蛍光全体の強度を測ります。このとき、電子励起状態の振動基底状態や振動励起状態(図では太い横線が各電子状態の振動基底状態を示し、その上の細い横線がその電子状態の振動励起状態を示しています。)へ励起されますので、励起光の波長は電子励起状態の各振動状態のエネルギーに対応したものとなります。溶液などでは、振動励起状態へ励起してもすぐにその電子状態の振動基底状態へ緩和されますので、緑の矢印全体の強度というのは、励起された分子の数に比例します。つまり、励起スペクトルは分子の吸収スペクトルに比例したようなスペクトルが得られるわけです。(もちろん、いろいろ例外はありますが)

さて一方、質問者様のおっしゃる蛍光スペクトルは緑色の矢印をさらに分光器などで分散させて矢印一本一本を別々の波長として観測するスペクトルです。つまり、波長は電子励起状態の振動基底状態から電子基底状態の振動励起状態のエネルギーに対応したものとなります。

蛍光スペクトルにおいて、励起光の波長がわからないと言うことですが、溶液などでは励起分子はすぐに電子励起振動基底状態へ緩和しますので、励起光の波長を変えて励起する分子の振動状態を変えても、蛍光スペクトルはすべて電子励起振動基底状態からのもので、波長とその強度比は変わりません(励起スペクトルのように全体の強度はかわりますが)。このような場合、励起光の波長を書かないことが多いです。

図でもわかるように、励起光の波長と蛍光発光の波長はは電子励起振動基底状態のエネルギーをはさんで、励起光は電子励起状態の振動エネルギーだけ高いエネルギー(短い波長)になり蛍光は電子基底状態の振動エネルギーだけ引いエネルギー(長い波長)になり、それぞれの振動エネルギー構造が似ていれば、鏡像のような形になることがわかります。

以上、「励起光が書いていない」ということから類推して、すべて溶液の蛍光測定と仮定してお答えしました。気体や分子線を使ったLIFではちょっと話がかわってきますので、その点はご留意ください。

参考URL:http://www.jp.jobinyvon.horiba.com/product_j/spex/principle/index.htm#01

#1さんの説明の通りですが、いくらか、図などがあった方がわかりやすいかもしれませんので、参考URLにgoogleで出て来たページを紹介します。ページ中程にあるJablonski Diagramの左側が蛍光について示した物です。以下、おそらく溶液の蛍光についての質問であると予想して、述べます。

さて、蛍光の過程について述べますと、蛍光とは図にある青の矢印に対応する励起光を分子が吸収します。その後、図では黒色の矢印で示された光を発しない緩和過程(溶媒などに熱エネルギー等の形でエネルギーを渡し、エネルギ...続きを読む


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