液クロを使った分析系についてみてもらえませんか...？

Question

自分は今、植物の葉っぱからの抽出実験で液体クロマトグラフィーを使っています。
そのうえで、分析系での計算が合わずに困っています。
見ていただけると嬉しいです。
以下、分析系を記します。


乾燥粉砕葉を約10g正確に秤量（Gｇとする）。
これを50mLの80%メタノール水にて１時間抽出する。
濾過してのち、メスシリンダーで容量をはかる（VｍL）。
80%メタ水を追加して50mLにメスアップして撹拌する。
そのうち20mLをバイアルに保存する（母画分とする）。

10mLをヘキサン10mLで分配抽出する。
分配抽出したあとのメタ水の画分をふたたび、あらたなヘキサン10mLで分配抽出する。
同じ操作を繰り返し、メタ水の画分を計4回、ヘキサン10mLにて分配抽出する。

4回分配抽出後のメタ水画分の容量をはかる（V'ｍL）。
のち、ここに80%メタ水を加えて10mLにメスアップして撹拌する（精製画分とする）。

～液クロ～
母画分から1mLを液クロ用注入フィルターに通してのち、5μLを注入する。
精製画分から1mLを液クロ用注入フィルターに通してのち、5μLを注入する。


得られたエリア面積と検量線から、母画分での目的成分の濃度がXmg/ml,
精製画分での目的成分の濃度がX'mg/mlとなったとします。
このとき、母画分では
液クロ注入した5μLでの濃度はメスアップされた50mLでの濃度に等しく、このときは
X×50 mgの目的成分があり、
メスアップする前の容量がVmLなので、50X/V mg/ml の濃度、
もとは50mLに抽出されているので、そのときは2500X/V mg あり、
乾燥粉砕葉がGgとすると、粉砕葉1gに対しての目的成分の濃度は2500X/VG mg/gとなる。

精製画分では、
液クロ注入した5μLでの濃度は分配抽出後にメスアップされた10mLでの濃度に等しいので、
このとき　10X' mg の目的成分がある。メスアップする前の容量がV' mLなので、この時の濃度は10X'/V' mg/ml となる。
分配抽出でヘキサンに分配された目的成分はほとんどないと仮定すると、これは50ｍLにメスアップした時の濃度と同じになる。あとは上と同じ計算をして、乾燥粉砕葉1gに対しての目的成分の濃度は25000X'/VV'G mg/gとなる。

この計算は正しいでしょうか？
実測値を入れてみると、どうしても精製画分での最終濃度が母画分でのそれよりも大きくなってしまいます。。
なにが間違っているのか、教えてもらえるとうれしいです。。。
分配抽出する目的は、クロロフィルを除くためで、液クロのカラムにクロロフィルを吸着させたくないので、手間がかかっています。
最終的には、母画分をそのまま液クロに注入することはないようにしたいと考え、精製画分にて多サンプルを評価したいのですが、精製画分と母画分で計算が合わないと正確に測定できず、困っています。
どうかお願いいたします。

Zincer · Accepted Answer

理想的な状態では
Ｖ’＝10ｍｌ
Ｘ＝Ｘ’
となり、2つの式は等しくなりますから、式自体はあっているように思います。

気になる点は
１．分配抽出でヘキサンに分配された目的成分はほとんどないと仮定すると、
という仮定
２．ヘキサン処理（仮称）した時点での容量の校正
１０ｍｌ→（ヘキサン処理）→Ｖ’ｍｌ→（メスアップ）→１０ｍｌ
の操作ですね。

目的成分を抽出したメタ水が、
・目的成分の濃度を変えず
・分液操作によって容積の一部をロスした
場合に適応できる換算式ですね？

つまり、
・メタノール水溶液の蒸発
・メタノールのヘキサンへの溶解
すら誤差になると思います。

ヘキサン処理によって、
「分配抽出でヘキサンに分配される目的成分の割合は一定」
または
「分配抽出で濃縮される目的成分の割合は一定」
とできる条件での操作を行い、
「最初のメタ水での濃度」と「ヘキサン処理後の濃度」の関係を換算できるようにしなくてはならないのかもしれません。
「最初のメタ水」を希釈したものを同じようにヘキサン処理し、線形性の確認（または検量線の作成）が必要かと思います。
この場合には、最後の「メスアップ操作」は不要です。

液クロを使った分析系についてみてもらえませんか...？

理想的な状態では

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